大鼠Smad7真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及在肝星狀細胞中抗纖維化特性研究.pdf

1、目的：肝纖維化(HF)是多種慢性肝病病情發(fā)展的共同病理基礎(chǔ)和病理特征,是臨床肝病向肝硬化發(fā)展的中間環(huán)節(jié),是可逆性病變,以細胞外基質(zhì)(ECM)增加為特征。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中最重要的促進因子,是ECM沉積的關(guān)鍵介質(zhì),肝星狀細胞(HSC)活化則是其中心環(huán)節(jié)。Smad蛋白是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,介導(dǎo)TGF-β由細胞膜進入細胞核,Smad7負性調(diào)控TGF-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究構(gòu)建并鑒定大鼠Smad7基因pcDNA3.1(

2、+)真核表達質(zhì)粒,脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HSC-T6細胞,旨在觀察外源Smad7基因可否有效轉(zhuǎn)染肝星狀細胞并初步研究其抗纖維化的效果,為進一步探討Smad7在TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的抗纖維化機制及用于肝纖維化治療做準(zhǔn)備。 方法：根據(jù)大鼠Smad7基因全序列,設(shè)計特異性引物,TRIzol法抽提冰凍大鼠肝組織總RNA,RT-PCR獲得Smad7 cDNA片段,應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建Smad7/pcDNA3.1(+)重組質(zhì)粒,雙酶切證實

3、的陽性克隆進行測序鑒定。脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HSC-T6,分為正常對照、空質(zhì)粒組及轉(zhuǎn)染組,運用免疫細胞化學(xué)染色法檢測HSC中Smad7及a-SMA定位和表達,分別采用RT-PCR法和Western-blot法檢測HSC中Smad7 mRNA及蛋白水平的表達:Western-blot檢測a-SMA表達；RT-PCR檢測TGF-β1及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達。 結(jié)果：成功構(gòu)建大鼠Smad7真核表達質(zhì)粒；Smad7及a-SMA在胞漿中表達

4、,a-SMA表達陽性提示HSC-T6被激活:Smad7轉(zhuǎn)染組與正常對照、空質(zhì)粒組比較:Smad7mRNA表達顯著增加1.053±0.009(P=0.009),蛋白水平明顯上調(diào)0.083±0.016(P=-0.020),a-SMA蛋白水平明顯下降0.518±0.085(P=0.032);Smad7轉(zhuǎn)染組TGF-β1、Ⅰ型膠原mRNA表達降低0.961±0.013、0.592±0.096(P=0.000;P=0.004):Ⅲ型膠原mRNA表

5、達差異無統(tǒng)計學(xué)意義0.910±0.018(P=0.950)。正常對照、空質(zhì)粒組Smad7mRNA和蛋白水平、a-SMA蛋白水平、TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.944,0.644,0.612,0.595,0.967,0.950)。 結(jié)論： 1、大鼠Smad7/PcDNA3.1(+)真核細胞表達重組質(zhì)粒構(gòu)建成功； 2、Smad7及a-SMA在細胞漿中表達,a-SMA表達陽性提示HSC