基因轉(zhuǎn)染高表達(dá)Smad7對大鼠腹膜透析模型腹膜纖維化的治療作用.pdf

1、腹膜透析(Peritoneal dialysis，PD)是腎臟替代治療的主要方法之一。PD作為終末期腎臟病一體化治療的初始選擇方式有很多優(yōu)點(diǎn)：延緩殘余腎功能下降速度，中分子物質(zhì)清除效果好，提供持續(xù)超濾，利于血壓控制與液體平衡，病人有更獨(dú)立的生活方式，就業(yè)率高等。PD開始的前3～5年與血液透析(Haemodialysis，HD)相比生存率基本相似。然而PD過程中，腹膜長期與含糖非生理性的腹透液持續(xù)接觸、以及腹膜炎的反復(fù)發(fā)生均可介導(dǎo)腹膜纖維

2、化的發(fā)生，導(dǎo)致超濾失敗，是病人退出腹膜透析的主要原因之一，也是制約腹膜透析發(fā)展的主要障礙，目前尚無有效的解決辦法。因此探討腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、從而尋找有效的治療措施，是目前亟待解決的一個重要課題。 近年來的研究發(fā)現(xiàn)，TGF—β是重要的促纖維化因子，主要通過其下游信號蛋白Smads的活化發(fā)揮作用。研究表明腎纖維化、肝纖維化、肺纖維化以及腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展均與TGF—β/Smad信號蛋白活化，誘導(dǎo)上皮或間皮細(xì)胞向

3、肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(epithelial—mesenchymal transition，EMT)以及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過度積聚有關(guān)。 Smad7是TGF—β/Smad信號通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)信號蛋白。研究證實(shí)，將Smad7基因轉(zhuǎn)入腎臟、肝臟及肺臟組織中，可以通過特異性阻斷Smad2/3的磷酸化顯著抑制相應(yīng)組織器官纖維化的發(fā)生。 本課題組的前期工作發(fā)現(xiàn)，腹腔內(nèi)注射4.25％含糖腹

4、膜透析液和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可以成功建立大鼠腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化模型；在腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，TGF—β/Smad信號蛋白顯著上調(diào)和活化，提示TGF—β/Smad信號蛋白可能參與了大鼠腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展；進(jìn)一步的研究證實(shí)，應(yīng)用超聲微泡技術(shù)將TGF—β抑制性信號蛋白Smad7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大鼠腹膜組織，上調(diào)表達(dá)Smad7可通過抑制TGF—β受體調(diào)控蛋白Smad2/3的活化，顯著抑制腹膜間皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)

5、分化及細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，改善腹膜功能，提示早期上調(diào)表達(dá)Smad7對于腹膜透析相關(guān)的腹膜纖維化具有預(yù)防作用。 本研究的主要目的就探討基因轉(zhuǎn)染高表達(dá)Smad7在已經(jīng)發(fā)生腹膜纖維化的大鼠腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化是否具有治療作用，從而進(jìn)一步揭示腹膜纖維化的發(fā)生機(jī)制，并為臨床治療腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究的主要內(nèi)容包括： 1、大鼠腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化模型的建立。 2、超聲微泡介導(dǎo)的外源性Smad7基因轉(zhuǎn)染

6、及成功表達(dá)。 3、基因轉(zhuǎn)染高表達(dá)Smad7對腹膜透析大鼠腹膜纖維化的治療作用。 一、大鼠腹膜纖維化模型的建立 目的：探討TGF—β/Smad信號蛋白在4.25％葡萄糖腹膜透析液與LPS誘導(dǎo)的大鼠腹膜纖維化模型形成過程中的動態(tài)變化及意義。 方法：18只SD雄性大鼠(160～170g)，隨機(jī)分為2周模型組(n=6)、4周模型組(n=6)和6周模型組(n=6)，每日腹腔內(nèi)注射4.25％腹膜透析液(100mL/k

7、g)，同時腹腔內(nèi)注射LPS(0.6mg/kg，2～3次/周)。另取未做任何處理的SD雄性大鼠(n=6)作為正常對照組。分別于2周、4周和6周殺檢大鼠，行腹膜平衡實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)確量取超濾量，留取0、4小時血清與腹腔流出液標(biāo)本，計算葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量，用光鏡觀察壁層腹膜組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，臟層腹膜組織用RT—PCR、Western雜交或間接免疫熒光的方法檢測TGF—β1、p—Smad2/3、α—SMA、MMP—2、COL—I及PAI-1的基因和蛋白表達(dá)水平，

8、用明膠酶譜法檢測MMP—2的活性。 結(jié)果：與正常對照組比較，2周模型組壁層腹膜組織已有明顯的增厚，同時伴隨有超濾量的下降與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量的增加；與正常對照組比較，2周、4周和6周模型組TGF—β1、p—Smad2/3、α—SMA、PAI-1、COL—I蛋白和基因水平的表達(dá)以及MMP—2活性的表達(dá)明顯增強(qiáng)，但各模型組之間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。 小結(jié)：腹腔內(nèi)注射4.25％葡萄糖腹膜透析液與脂多糖2周可成功誘導(dǎo)符合臨床特征的腹

9、膜纖維化模型；TGF—β/Smad信號蛋白的活化可能參與了葡萄糖腹膜透析液與脂多糖誘導(dǎo)的大鼠腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展。適當(dāng)調(diào)整脂多糖劑量，可成功誘導(dǎo)在6周內(nèi)腹膜纖維化持續(xù)存在且緩慢進(jìn)展的動物模型。 二、超聲微泡介導(dǎo)的外源性Smad7基因轉(zhuǎn)染及成功表達(dá) 目的：利用超聲微泡技術(shù)將Smad7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于已經(jīng)發(fā)生腹膜纖維化的腹膜組織中，為進(jìn)一步觀察Smad7的治療作用提供技術(shù)平臺。 方法：(1)將pTRE—m2Smad7質(zhì)粒及

10、pEFpurop—Tet—on質(zhì)粒相同質(zhì)量用生理鹽水稀釋，每支發(fā)泡劑用5ml生理鹽水溶解，二者以體積比1:1充分混勻，Smad7終濃度為100μg/ml，分別以4ml、5ml、6ml注射入腹腔，并體外超聲處理，觀察腹腔內(nèi)液體注射量對轉(zhuǎn)染效率的影響；(2)將pTRE—m2Smad7質(zhì)粒及pEFpurop—Tet—on質(zhì)粒相同質(zhì)量用生理鹽水稀釋，每支發(fā)泡劑用5ml生理鹽水溶解，二者以體積比1:1充分混勻，Smad7終濃度為50μg/ml、1

11、00μg/ml、150μg/ml，依據(jù)前一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇每只大鼠腹腔內(nèi)注射體積為6ml，并體外超聲處理，觀察注射濃度對轉(zhuǎn)染效率的影響；(3)實(shí)驗(yàn)動物給予腹腔內(nèi)注射4.25％腹膜透析液和脂多糖14天后，利用超聲微泡技術(shù)將Smad7質(zhì)粒(終體積6ml、終濃度150μg/ml)轉(zhuǎn)染于大鼠腹膜組織，并于間隔14天后再次轉(zhuǎn)染，于首次轉(zhuǎn)染后第0、3、7、10、14、17、21及28天殺檢動物，觀察轉(zhuǎn)染效率，并對超聲微泡的安全性進(jìn)行評估。 結(jié)

12、果：腹腔內(nèi)質(zhì)粒微泡混合物取注射量6ml，濃度150μg/ml時，外源基因Smad7轉(zhuǎn)染效率最高，持續(xù)到14天仍有較高水平表達(dá)，間隔14天再次轉(zhuǎn)染，可以獲得外源基因Smad7在28天內(nèi)持續(xù)較高水平的表達(dá)；外源基因在大鼠肝、腎、心、肺、脾臟以及腸管中均無表達(dá)，轉(zhuǎn)染前后肝腎功能(AST、ALT、LDH、Cr)及體重?zé)o明顯變化。 小結(jié)：超聲介導(dǎo)微泡法是一種無創(chuàng)、無毒、高效的基因轉(zhuǎn)染方法，能有效地將外源基因Smad7轉(zhuǎn)染至腹膜透析模型的腹

13、膜組織中并上調(diào)表達(dá)，為腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化的基因治療提供新的途徑。 三、基因轉(zhuǎn)染高表達(dá)Smad7對大鼠腹膜纖維化的治療作用 目的：探討基因轉(zhuǎn)染高表達(dá)Smad7對大鼠腹膜纖維化和腹膜功能的治療作用。 方法：24只SD雄性大鼠(160～170g)，隨機(jī)分為4組：正常對照組(n=6)；腹膜纖維化模型組(n=6)，腹腔內(nèi)注射4.25％腹膜透析液與脂多糖；空載體組(n=6)與Smad7治療組(n=6)。空載體組和Smad

14、7治療組在與腹膜纖維化模型組相同處理的基礎(chǔ)上，分別于第14天轉(zhuǎn)染pTRE與pEFpurop—Tet—on，pTRE—m2Smad7與pEFpurop—Tet—on質(zhì)粒。4周殺檢大鼠，做腹膜平衡試驗(yàn)，準(zhǔn)確量取超濾量，留取0、4小時血清與腹腔流出液標(biāo)本，計算葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量，4小時后，取壁層腹膜組織作形態(tài)學(xué)觀察，臟層腹膜組織用Western雜交、RT—PCR的方法檢測p—Smad2/3、α—SMA、MMP—2、E—鈣粘素、COL—I及PAI—I

15、蛋白及mRNA水平的表達(dá)。 結(jié)果：腹膜組織學(xué)檢查，與模型組及空載體組比較，Smad7治療組腹膜厚度明顯減輕(P<0.05)，超濾量增加(P<0.01)，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量下降(P<0.05)；與模型組及空載體組比較，Smad7治療組p—Smad2/3、α—SMA、MMP—2、COL—I及PAI—I蛋白表達(dá)水平及MMP—2活性的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)，Smad7治療組E—鈣粘素蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01)；α—SMA、E—

16、鈣粘素、MMP—2、COL—I及PAI-1mRNA水平的表達(dá)與其蛋白水平的表達(dá)趨勢一致。 小結(jié)：TGF—β抑制性信號蛋白Smad7可通過抑制受體調(diào)控信號蛋白Smad2/3的活化，部分逆轉(zhuǎn)了高糖透析液及脂多糖介導(dǎo)的腹膜纖維化，改善了腹膜的超濾和溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能。 總結(jié)： 1.腹腔注射4.25％腹膜透析液與脂多糖2周可成功誘導(dǎo)符合臨床特征的腹膜纖維化模型；TGF—β/Smad信號蛋白的活化參與了葡萄糖腹膜透析液與脂多糖誘