柑橘TCP家族生物信息學(xué)分析及CsTCP1轉(zhuǎn)錄因子參與果實(shí)成熟的功能驗(yàn)證.pdf

1、果實(shí)成熟是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受多個(gè)代謝途徑共同調(diào)控。目前，針對(duì)非躍變型果實(shí)成熟機(jī)制方面的研究較少。因此研究柑橘果實(shí)成熟相關(guān)的基因，并探究它們與果實(shí)成熟調(diào)控之間的關(guān)系，進(jìn)而選育出不同成熟期的優(yōu)良品種，對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展有重要意義。 TCP(TEOSINTEBRANCHEDI/CYCLOIDEA/PROLIFERATING CELLFACTOR)蛋白是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，參與植物葉的發(fā)育、花的對(duì)稱性、莖的分支等進(jìn)程，但在果實(shí)成熟上的研究較少

2、。前人通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及SSR分析發(fā)現(xiàn)柑橘CsTCP1基因可能參與果實(shí)的成熟。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)和基因表達(dá)兩種方法對(duì)柑橘TCP家族成員進(jìn)行研究。同時(shí)克隆CsTCP1基因，通過(guò)對(duì)該基因在番茄中的超量表達(dá)研究分析其功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1、柑橘全基因組共編碼20個(gè)TCP家族成員基因，編號(hào)分別為CsTCP1～CsTCP20，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系結(jié)果將CsTCPs分為兩個(gè)亞家族:ClassⅠ和ClassⅡ。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)它們都含

3、有典型的BHLH結(jié)構(gòu)域。除1號(hào)和4號(hào)染色體外，其它7條染色體均有TCP基因的分布。多數(shù)基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，無(wú)內(nèi)含子。
　　2、根據(jù)柑橘TCP家族成員在不同器官中的表達(dá)情況不同可將這些基因分為兩類，其中第一類基因較第二類表達(dá)量高。大部分基因在葉、花和果實(shí)中高表達(dá)，但在愈傷組織中相對(duì)低表達(dá)。此外，通過(guò)熒光定量PCR方法檢測(cè)CsTCPs基因在‘興錦101’與晚熟芽變果實(shí)花后六個(gè)不同時(shí)期的表達(dá)量，結(jié)果表明多數(shù)基因相對(duì)表達(dá)量在開(kāi)花之后215天達(dá)到

4、峰值，且在早熟與晚熟果實(shí)中差異較明顯。從而推測(cè)柑橘CsTCPs參與果實(shí)成熟發(fā)育進(jìn)程。
　　3、根據(jù)已登錄的柑橘TCP轉(zhuǎn)錄因子基因CsTCP1的cDNA編碼框序列，設(shè)計(jì)并合成特異引物CsTCP1F/CsTCP1R，并以‘興錦101’的cDNA做為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增CsTCP1基因，并通過(guò)TA方法克隆得到該基因，該序列與原序列比對(duì)相似度可達(dá)到100％。對(duì)克隆基因CsTCP1進(jìn)行亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)該基因定位于細(xì)胞核。通過(guò)抗性篩選，P

5、CR及qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株植株，結(jié)果獲得超表達(dá)CsTCP1的轉(zhuǎn)基因植株。表型觀察發(fā)現(xiàn)超表達(dá)番茄植株較野生型植株相比株高變矮。此外，超表達(dá)番茄果實(shí)與野生型果實(shí)相比果型偏長(zhǎng)，且在果實(shí)成熟過(guò)程中轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)比野生型番茄果實(shí)提前完成轉(zhuǎn)色。qRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中成熟相關(guān)基因與野生型番茄相比普遍上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明CsTCP1基因可能正調(diào)控果實(shí)成熟相關(guān)基因。
　　通過(guò)對(duì)柑橘TCP家族成員基因進(jìn)行定量分析，推測(cè)該家族成員基因