柑橘TCP家族生物信息學(xué)分析及CsTCP1轉(zhuǎn)錄因子參與果實成熟的功能驗證.pdf

1、果實成熟是一個復(fù)雜的過程，受多個代謝途徑共同調(diào)控。目前，針對非躍變型果實成熟機制方面的研究較少。因此研究柑橘果實成熟相關(guān)的基因，并探究它們與果實成熟調(diào)控之間的關(guān)系，進而選育出不同成熟期的優(yōu)良品種，對柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展有重要意義。 TCP(TEOSINTEBRANCHEDI/CYCLOIDEA/PROLIFERATING CELLFACTOR)蛋白是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，參與植物葉的發(fā)育、花的對稱性、莖的分支等進程，但在果實成熟上的研究較少

2、。前人通過轉(zhuǎn)錄組測序及SSR分析發(fā)現(xiàn)柑橘CsTCP1基因可能參與果實的成熟。
　　本實驗通過生物信息學(xué)和基因表達兩種方法對柑橘TCP家族成員進行研究。同時克隆CsTCP1基因，通過對該基因在番茄中的超量表達研究分析其功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1、柑橘全基因組共編碼20個TCP家族成員基因，編號分別為CsTCP1～CsTCP20，系統(tǒng)進化關(guān)系結(jié)果將CsTCPs分為兩個亞家族:ClassⅠ和ClassⅡ。序列比對發(fā)現(xiàn)它們都含

3、有典型的BHLH結(jié)構(gòu)域。除1號和4號染色體外，其它7條染色體均有TCP基因的分布。多數(shù)基因結(jié)構(gòu)簡單，無內(nèi)含子。
　　2、根據(jù)柑橘TCP家族成員在不同器官中的表達情況不同可將這些基因分為兩類，其中第一類基因較第二類表達量高。大部分基因在葉、花和果實中高表達，但在愈傷組織中相對低表達。此外，通過熒光定量PCR方法檢測CsTCPs基因在‘興錦101’與晚熟芽變果實花后六個不同時期的表達量，結(jié)果表明多數(shù)基因相對表達量在開花之后215天達到

4、峰值，且在早熟與晚熟果實中差異較明顯。從而推測柑橘CsTCPs參與果實成熟發(fā)育進程。
　　3、根據(jù)已登錄的柑橘TCP轉(zhuǎn)錄因子基因CsTCP1的cDNA編碼框序列，設(shè)計并合成特異引物CsTCP1F/CsTCP1R，并以‘興錦101’的cDNA做為模板，通過PCR方法擴增CsTCP1基因，并通過TA方法克隆得到該基因，該序列與原序列比對相似度可達到100％。對克隆基因CsTCP1進行亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)該基因定位于細(xì)胞核。通過抗性篩選，P

5、CR及qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因植株植株，結(jié)果獲得超表達CsTCP1的轉(zhuǎn)基因植株。表型觀察發(fā)現(xiàn)超表達番茄植株較野生型植株相比株高變矮。此外，超表達番茄果實與野生型果實相比果型偏長，且在果實成熟過程中轉(zhuǎn)基因番茄果實比野生型番茄果實提前完成轉(zhuǎn)色。qRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因番茄果實中成熟相關(guān)基因與野生型番茄相比普遍上調(diào)表達，說明CsTCP1基因可能正調(diào)控果實成熟相關(guān)基因。
　　通過對柑橘TCP家族成員基因進行定量分析，推測該家族成員基因