PEDV-TGEV-PDCoV快速檢測方法的建立及PEDV COE基因和ORF3基因遺傳變異研究.pdf

1、豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）和豬傳染性胃腸炎（Transmissible Gastroenteritis，TGE）分別是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Coronavirus，TGEV）引起的一種急性、高度接觸性腸道疾病。各個年齡段的豬均可以感染發(fā)病

2、，尤其以一周齡以內(nèi)的仔豬為主。豬丁型冠狀病毒又稱豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）是在美國PEDV暴發(fā)時期新發(fā)現(xiàn)的一種豬腹瀉病原，2013年至今，在豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎廣泛存在放的情況下，PDCoV也隨之出現(xiàn)。這三種病的臨床發(fā)病情況基本相似，均使發(fā)病豬呈現(xiàn)嘔吐和水樣腹瀉癥狀，一般的臨床癥狀較難鑒別。
　　為了快速鑒別診斷豬丁型冠狀病毒、豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎的流行和混合感染的情況，建立了一套能快速、準(zhǔn)確檢測PEDV、TG

3、EV和PDCoV三重RT-PCR檢測方法。為了提高對PEDV檢測的準(zhǔn)確性和靈敏性，避免實驗過程中假陽性的出現(xiàn)，建立了一套巢式 RT-PCR檢測方法，可用于較低濃度模板的PEDV的檢測。試驗還對我國20株P(guān)EDV流行株的ORF3基因和COE基因分別進(jìn)行了遺傳變異分析。
　　根據(jù)冠狀病毒保守序列 N基因設(shè)計篩選出特異性高的三對引物，再進(jìn)行各種試驗對不同反應(yīng)條件和體系進(jìn)行優(yōu)化，確定 PEDV、TGEV濃度為0.24μM，PDCoV濃度為

4、0.32μM；10×PCR緩沖液為1 mM，Taq DNA聚合酶終濃度為2.5U，dNTP終濃度0.2 mmol/L；退火溫度為56℃。用上述方法對PRRSV、CSFV、RV、PPV進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果為陰性；多重RT-PCR檢出PEDV、TGEV、PDCoV的最低含量分別為33.4pg、28.56pg、322.3pg。該方法敏感性和特異性較好，為今后各個地區(qū)腹瀉病原的快速準(zhǔn)確的鑒別診斷提供一個很好的方法。利用建立的三重RT-PCR方法和單重

5、RT-PCR分別對149份臨床樣品進(jìn)行檢測，所有檢測樣品中PEDV陽性率是46.3％，PDCoV陽性率是1.4%，TGEV和混合感染在本次檢查中未檢出，且與單重RT-PCR的檢測結(jié)果一致。
　　由于PEDV在模板含量較低時，用常規(guī)RT-PCR難以得到滿意的結(jié)果，本試驗還建立了一套巢式RT-PCR。經(jīng)過特異性與靈敏性試驗，發(fā)現(xiàn)該方法對豬的其他病毒的擴(kuò)增為陰性；用常規(guī) RT-PCR能檢測出284pg/μL；而巢式 RT-PCR可以檢測

6、出2.84pg/μL，結(jié)果顯示它提高了反應(yīng)敏感性。
　　本試驗對20株P(guān)EDV的ORF3基因和COE片段進(jìn)行了系統(tǒng)的遺傳變異分析。比較分析發(fā)現(xiàn)其核苷酸同源性95.5%~100%；氨基酸同源性為84.9%~100%（除JXNC和GDZH）；核苷酸和氨基酸與中國其他毒株存在相似的突變；ORF3基因進(jìn)化樹分析顯示，20株P(guān)EDV流行毒株均在G2分支上，與經(jīng)典毒株CV777親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與中國其他毒株親緣關(guān)系密切。PEDV ORF3基因的

7、特征可用于區(qū)分強弱毒，在ORF3基因第245~295位置處沒有49~51bp的缺失，說明這20株流行株屬于強毒株。PEDV的S基因的抗原表位域（COE基因）分析顯示其核苷酸同源性95.8%~100%，氨基酸同源性為95.1%~100%；核苷酸和氨基酸分別有11個和5個共同突變位點；COE基因遺傳分析顯示，有兩株（JXTJ、JXBS）在G1分支上，其余18株均在G2上，和中國前幾年流行株與 DR13強毒株屬一個分支，與經(jīng)典毒株CV777親