2014-2015年河南省PEDV遺傳變異分析及ISG15與PEDV相互作用的初步探究.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）可以引起豬消化道的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致嘔吐、水樣腹瀉和脫水等臨床癥狀，其病原是豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea vrius,PEDV），不同年齡階段豬群均易感，哺乳仔豬最易感，死亡率最高，該病于1971年英國最先報道，我國在1976年首次報道，2010年來，豬流行性腹瀉病再次暴發(fā)，哺乳仔豬的感染率和死亡率達(dá)到了空前高度，給世界養(yǎng)殖業(yè)造

2、成了重大經(jīng)濟(jì)損失，鑒于該病的嚴(yán)重性，對該病病原的研究有重要的意義。
　　干擾素刺激基因15（interferon-stimulated gene15,ISG15）編碼的ISG15蛋白是最早發(fā)現(xiàn)的類泛素修飾蛋白，被Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)表達(dá)，屬于類泛素修飾蛋白家族，ISG15的高水平表達(dá)可以影響病毒的復(fù)制，而PEDV的先天免疫與ISG15的關(guān)系尚不明確。本研究以干擾素缺陷型猴腎細(xì)胞系（Vero）為模型，對ISG15在PEDV復(fù)制過程中的作用

3、進(jìn)行了初步的探討。
　　基于以上背景，本研究對河南省流行性腹瀉病毒流行株變異情況進(jìn)行監(jiān)測和探究，同時構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)ISG15蛋白的細(xì)胞系，在此基礎(chǔ)上探究了PEDV與ISG15蛋白的相互作用，為進(jìn)一步研究ISG15抗病毒機(jī)制和PEDV逃逸細(xì)胞先天免疫機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。研究的主要內(nèi)容分為以下三個部分：
　　1.河南省2014-2015年豬流行性腹瀉病毒流行株遺傳進(jìn)化分析
　　對15株2014-2015年間河南省PEDV流行株S

4、基因進(jìn)行克隆及序列測定，與河南省2011-2013年間流行株以及國內(nèi)、外代表毒株進(jìn)行同源性及遺傳變異分析，并對這些毒株S基因的N-糖基化位點(diǎn)及跨膜螺旋區(qū)域進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果表明:本試驗得到的15株毒株之間S基因核苷酸同源性為97.0-99.8％，氨基酸同源性為97.0-99.5%；與2011-2013年河南流行株核苷酸同源性為97.1-99.0%，氨基酸同源性為97.2-98.8%，與其他地區(qū)流行毒株核苷酸同源性為92.2%-99.0%，氨

5、基酸同源性為91.9%-99.0%；與經(jīng)典毒株相比，S1區(qū)域N端存在15bp的插入和6bp的缺失，核苷酸同源性為91.7%-93.6%，氨基酸同源性為92.0%-93.6%。系統(tǒng)發(fā)育建樹結(jié)果顯示目前的流行毒株與經(jīng)典毒株處于不同的兩個群，流行毒株分處不同亞群。對N-糖基化位點(diǎn)及跨膜螺旋區(qū)域的預(yù)測得知2014-2015年河南省PEDV與經(jīng)典株相比出現(xiàn)變異，與2010年暴發(fā)時相比存在部分突變，毒株之間存在部分差異。
　　2.穩(wěn)定過表達(dá)豬

6、ISG15基因Vero細(xì)胞系的建立
　　構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)豬ISG15基因的Vero細(xì)胞系，利用真核轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)（PiggyBac,PB）將豬源ISG15基因轉(zhuǎn)染入Vero細(xì)胞中，通過嘌呤霉素抗性和綠色熒光進(jìn)行雙重篩選獲得陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞，再經(jīng)過克隆純化得到單個陽性細(xì)胞株，將細(xì)胞進(jìn)行傳代后檢測，借助實(shí)時定量熒光基因擴(kuò)增（Real-time Quantitative PCR,qPCR）及蛋白質(zhì)免疫印跡（western-bloting,WB）方法

7、鑒定該基因的表達(dá)，結(jié)果表明，篩選得到的piggybc-ISG15-Vero細(xì)胞株可穩(wěn)定表達(dá)ISG15，表明穩(wěn)定表達(dá)豬ISG15基因的Vero細(xì)胞系構(gòu)建成功，為進(jìn)一步研究豬ISG15基因的功能以及作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　3.ISG15和PEDV相互作用的初步研究
　　探究ISG15蛋白和PEDV相互作用關(guān)系，為后續(xù)研究PEDV逃逸細(xì)胞先天免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ)，將PEDV疫苗株CV777分別接種于piggybc-ISG15-Ver