miRNAs在LPS誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞中炎性反應(yīng)中的表達(dá)及miR-223參與調(diào)控Toll樣受體信號通路_初探.pdf

1、微小RNA(microRNA,miRNA)是一類非蛋白編碼的單鏈小RNA，大小約20~25nt，具有高度保守性、時序表達(dá)特異性，其表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控。miRNA通過直接結(jié)合到靶mRNA分子的3'非翻譯區(qū)(3'untranslated regions,UTRs)，進(jìn)行互補配對，抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯或誘導(dǎo)其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。研究表明miRNAs參與眾多生理疾病過程的調(diào)控，其表達(dá)的紊亂與疾病發(fā)生的機制密切相關(guān)。反芻動

2、物乳房炎(mastitis)，尤其是奶牛乳房炎(bovine mastitis)是世界范圍內(nèi)迄今為止仍未得到有效解決的頑疾，嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖業(yè)和乳業(yè)的發(fā)展。已有研究表明，miRNAs在乳腺炎癥反應(yīng)過程中的表達(dá)有明顯變化，可能參與了乳腺炎癥反應(yīng)的調(diào)控，但具體機制尚不明確。本研究旨在明確炎癥若干相關(guān)的miRNAs在LPS誘導(dǎo)的乳腺炎癥反應(yīng)中的表達(dá)變化，對miR-223在Toll樣受體信號通路中的影響進(jìn)行初探，為反芻動物乳房炎防治新靶點的發(fā)現(xiàn)提

3、供實驗依據(jù)。
　　本研究以不同濃度劑量的LPS刺激小鼠乳腺上皮(EpH4-Ev)細(xì)胞48h，qRT-PCR檢測炎癥相關(guān)miRNAs(miR-223、miR-146a、miR-181a和miR-155)的表達(dá)變化。qRT-PCR檢測結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)EpH4-Ev細(xì)胞炎癥反應(yīng)48h時，4種炎癥相關(guān)miRNA的表達(dá)均顯著增加(P<0.05)，并呈現(xiàn)不同程度的劑量依賴性。利用RT-PCR方法從小鼠乳腺上皮細(xì)胞基因組DNA中對pre-m

4、iR-223基因進(jìn)行克?。粯?gòu)建了以質(zhì)粒Minicircle、PiggyBac轉(zhuǎn)座子和pcDNA3.1(+)為母本的3種miR-223真核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染整合到EpH4-Ev細(xì)胞，通過觀察GFP熒光、qRT-PCR檢測miR-223基因在EpH4-Ev細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明成功構(gòu)建了Mini-miR-223、PB-miR-223和pcD-miR-223三個真核表達(dá)載體。
　　為探索miR-223對炎癥反應(yīng)過程中最重要的

5、信號通路—TLR信號通路相關(guān)分子的影響，我們將miR-223的過表達(dá)載體及miR-223inhibitor轉(zhuǎn)染至EpH4-Ev細(xì)胞，qRT-PCR檢測TLR信號通路相關(guān)分子表達(dá)變化，Western blot檢測其蛋白水平的變化。實驗結(jié)果表明，PB重組質(zhì)粒組過表達(dá)miR-223后，與其PB空載組相比，TLR4、NF-кB、IL-6的表達(dá)水平有不同程度下調(diào)，但無統(tǒng)計學(xué)差異；MyD88、TNF-α表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)；IL-1β表達(dá)明

6、顯下調(diào)，差異極顯著(P<0.001)；抑制miR-223的表達(dá)后，與上述結(jié)果基本相反，說明miR-223基因參與了TLR信號通路相關(guān)分子的調(diào)控。Western blot結(jié)果顯示：在過表達(dá)miR-223的PB組，IL-6蛋白的含量與其對照組相比，顯著下降(P<0.05)，在過表達(dá)miR-223的pcDNA3.1(+)組，IL-6蛋白的含量與其對照組相比，有下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義；NF-кB蛋白的含量在PB和pcDNA3.1(+)兩個重組