Toll樣受體信號通路在角膜煙曲霉菌感染中的作用.pdf

1、第一部分：Toll樣受體2和4信號通路介導(dǎo)的人角膜上皮細胞對煙曲霉菌的炎性反應(yīng) 目的：研究Toll樣受體2和TLR4信號通路介導(dǎo)的人永生化角膜上皮細胞對煙曲霉菌孢子、上清、菌絲體抗原的炎性反應(yīng)。 方法：采用自制的煙曲霉菌孢子、上清和菌絲體抗原，刺激培養(yǎng)的THCE細胞。以Real-time PCR檢測THCE細胞TLR2、TLR4 mRNA的表達；以Western blot檢測THCE細胞TLR2、TLR4的表達及pIκB

2、的活化；以酶聯(lián)免疫吸附試驗方法檢測THCE細胞培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的濃度；用TLR2和/或TLR4中和抗體特異性封閉TLR2和/或TLR4，或用尾葉香茶菜丙素特異性抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB活性，觀察調(diào)節(jié)TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對角膜上皮細胞IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8表達的影響。 結(jié)果：①TLRs信號通路活化實驗：正常THCE細胞有TLR2及TLR4 mRNA及蛋白質(zhì)的表達。煙曲霉菌抗原以時

3、間依賴方式促進THCE中TLR2、TLR4的表達及細胞因子的分泌。煙曲霉菌孢子刺激THCE細胞30min后TLR2及TLR4的表達開始增多，分別為對照組的2和2.75倍(P＜0.05)，刺激4h時達高峰，分別為對照組的23.5和27倍(P＜0.0 1)。上清抗原或菌絲抗原刺激THCE 2h后，TLR2、TLR4 mRNA表達較對照組升高，分別為對照組的35.5倍、33.5倍和9.75倍、18倍(P＜0.01)，刺激6h時達高峰，分別為對

4、照組的53倍、58.5倍和29.75倍、57.5倍(P＜0.01)。煙曲霉菌孢子抗原刺激THCE細胞2h后IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的表達開始增多，分別為對照組的1.33倍、2.1倍、1.2倍、1.3倍(P＜0.05)，刺激4h后達更多，分別為對照組的2.7倍、5.3倍、2.6倍、2.6倍(P＜0.01)。煙曲霉菌上清及菌絲刺激THCE細胞2h后IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的表達開始增多，分別為對照組的1.

5、4倍、2.2倍、1.3倍、1.3倍和1.3倍、2倍、1.2倍、1.2倍(P＜0.05)，刺激后6h達更多，分別為對照組的3.7倍、6.6倍、3.2倍、3.2倍和3.2倍、6.3倍、2倍、2.8倍(P＜0.01)。煙曲霉菌孢子、上清或菌絲抗原刺激THCE細胞12h后，細胞TLR2及TLR4表達增高(P＜0.01)，PIkB活化(P＜0.01)，其培養(yǎng)上清內(nèi)IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8濃度升高(P＜0.01)，分別為未刺激組的

6、3.6倍、7.3倍、4.1倍和4.5倍；4.2倍、7.4倍、4.1倍和4.5倍；3.3倍、7.3倍、3.9倍和4.4倍。②TLRs信號通路調(diào)節(jié)實驗：在煙曲霉菌抗原刺激組，單純封閉TLR2或TLR4可抑制plkB的活性(P＜0.05)，聯(lián)合封閉TLR2和TLR4可明顯抑制pIkB-α的活性(P＜0.01)。煙曲霉菌孢子抗原刺激THCE細胞12h后，其培養(yǎng)上清內(nèi)IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8濃度升高，分別為未刺激組的3.6倍、7

7、.3倍、4.1倍和4.5倍；煙曲霉菌上清抗原刺激THCE細胞12h后，其培養(yǎng)上清內(nèi)IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8濃度升高，分別為未刺激組的4.2倍、7.4倍、4.1倍和4.5倍；煙曲霉菌菌絲體抗原刺激THCE細胞12h后，其培養(yǎng)上清內(nèi)IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8濃度升高，分別為未刺激組的3.3倍、7.3倍、3.9倍和4.4倍。在煙曲霉菌孢子抗原刺激組，聯(lián)合封閉TLR2和TLR4受體后，IL-1β、IL-6、TN

8、F-α和IL-8的分泌較刺激組分別減少了70.3％、85.8％、54.4％、57.4％；單純封閉TLR2受體后，IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的分泌較刺激組減少了63.1％、0.01％、29.3％、26.3％；單純封閉TLR4受體，IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的分泌較刺激組分別減少了48.3％、84.2％、28.3％、18.5％。在煙曲霉菌上清抗原刺激組，聯(lián)合封閉TLR2和TLR4受體后，IL-1β、1L-6、

9、TNF-α和IL-8的分泌較刺激組分別減少了74.3％、86.0％、53.7％、56.6％；單純封閉TLR2受體后，IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的分泌較刺激組減少了67.1％、0.01％、29.2％、25.4％；單純封閉TLR4受體，IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的分泌較刺激組分別減少了47.1％、84.6％、28.2％和22.7％。在煙曲霉菌菌絲抗原刺激組，聯(lián)合封閉TLR2和TLR4受體后，IL-1β、IL-

10、6、TNF-α和IL-8的分泌較刺激組分別減少了67.6％、86％、53.7％、57.5％；單純封閉TLR2受體后，IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的分泌較刺激組減少了58.3％、0.01％、26.8％、26.2％；單純封閉TLR4受體，IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的分泌較刺激組分別減少了51.7％、84.4％、25.3％、23.1％。在煙曲霉菌孢子、上清、菌絲抗原刺激組，阻斷NF-κB后，IL-1β、IL-6、

11、TNF-α和IL-8的分泌較刺激組分別減少了71.4％、86.2％、71.9％、74.4％，75％、86.3％、71.1％、74.1％，68.3％、86.2％、71.1％、74.5％。 結(jié)論：TLR2和TLR4參與了THCE對煙曲霉菌孢子、上清抗原及菌絲抗原的識別；并通過TLRs-NF-κB通路誘導(dǎo)下游炎性細胞因子的產(chǎn)生，介導(dǎo)角膜上皮細胞的炎性反應(yīng)。 第二部分：TLR2和TLR4在大鼠煙曲霉菌性角膜炎中的作用研究

12、 目的：建立大鼠煙曲菌角膜炎動物模型，了解真菌性角膜炎病變角膜的病理特點，進一步研究TLR2和TLR4信號通路在此病理過程中的表達及作用機制。 方法：以基質(zhì)注射法建立Wistar大鼠煙曲霉菌角膜炎動物模型。于菌液接種后1、3、5、7、11天處死大鼠，裂隙燈觀察角膜大體形態(tài)并進行臨床評分；角膜組織真菌培養(yǎng)行煙曲霉菌菌落計數(shù)及感染真菌鑒定；髓過氧化物酶活力測定中性粒細胞活性；病理學檢查檢測角膜及真菌形態(tài)；Real-time PCR檢

13、測TLR2、TLR4 mRNA的表達；免疫熒光組織化學及Western blot檢測TLR2、TLR4的表達；ELISA檢測IL-1β和IL-10的表達。 結(jié)果：在Wistar大鼠可成功建立煙曲霉菌性角膜炎的動物模型。裂隙燈檢查可見菌液接種后第1天角膜水腫；第5天角膜炎癥最嚴重，可見角膜潰瘍；第7、11天炎癥反應(yīng)開始減輕，可見角膜新生血管。角膜組織真菌培養(yǎng)鑒定為煙曲霉菌感染，菌落計數(shù)在菌液接種后第1天最多，隨后逐漸減少。髓過氧化

14、物酶活力在菌液接種后第1天開始增強，第5天活力最強，第7天開始逐漸減弱。病理結(jié)果示感染角膜組織水腫、壞死，基質(zhì)纖維排列紊亂，并可查見菌絲及多形核細胞浸潤。Real-time PCR、免疫熒光組織化學及Western blot結(jié)果示角膜TLR2和TLR4在感染后第1天表達開始增多，第5天表達最多，隨后逐漸降低。ELISA示正常角膜有極微量的IL-1β和IL-10表達；角膜中IL-1β的表達在接種后第1天開始增多，持續(xù)升高到第5天達最多，第

15、7天開始減少；而角膜中IL-10的表達在接種后第1天開始增多，呈持續(xù)性升高趨勢，在第11天達最多。 結(jié)論：在大鼠角膜可成功的建立真菌性角膜炎的動物模型；角膜組織中功能性的TLR2和TLR4介導(dǎo)炎性細胞因子的表達，參與角膜對真菌的免疫反應(yīng)及角膜炎的病理過程。 第三部分：Toll樣受體在真菌性角膜炎組織中的表達及其意義 目的：研究健康角膜組織及真菌性角膜炎角膜組織中Toll樣受體2和4及其介導(dǎo)的炎性細胞因子的表達及功

16、能，為真菌性角膜炎發(fā)病機制研究提供理論依據(jù)。 方法：收集37例真菌性角膜炎標本及11例健康角膜標本，刮片及培養(yǎng)鑒定真菌的類型；病理學檢查檢測角膜及真菌形態(tài)；Real-time PCR檢測TLR2、TLR4 mRNA的表達；Western blot及免疫熒光組織化學檢測TLR2、TLR4蛋白質(zhì)的表達；ELISA檢測IL-1β和IL-10的表達。 結(jié)果：37例真菌性角膜炎患者中，平均病程為19.9天，10～12月份發(fā)病率高男

17、女性別之比為1.47:1，平均年齡42歲，其中農(nóng)民占35例，21例患者可追溯到明確的眼部外傷史，如植物外傷史、鐵絲劃傷史、玻璃刺傷史等。37例標本均經(jīng)臨床檢查與實驗室診斷確認，角膜刮片鏡檢陽性率為91.9％，角膜標本真菌培養(yǎng)陽性率為62.2％，以鐮刀菌、曲霉菌為主要致病菌。病理學檢查示真菌性角膜炎病變角膜為廣泛化膿性炎癥，菌絲平行、斜行或垂直生長于膠原纖維之間。Real-time PCR檢測結(jié)果示37例真菌性角膜炎標本中TLR2、TLR