應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尋找非小細(xì)胞肺癌血清早期診斷標(biāo)志物的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景及目的:肺癌中約75％-85％為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，由于發(fā)病隱襲，缺乏有效的早期篩查手段，導(dǎo)致大多數(shù)肺癌病人治療難度大、預(yù)后差。現(xiàn)有的腫瘤標(biāo)記物尚無(wú)法應(yīng)用于肺癌的早期診斷。血清腫瘤標(biāo)志物對(duì)于診斷、判斷預(yù)后、療效評(píng)價(jià)和隨診等方面具有重要意義。因此，尋找肺癌相關(guān)的血清標(biāo)志物是目前研究的熱點(diǎn)之一?；陔p向凝膠電泳（2-DE）和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)為核心的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)具有高通量、靈敏、自

2、動(dòng)化的特點(diǎn)，是當(dāng)今腫瘤標(biāo)志物研究的重要技術(shù)手段之一。本課題擬應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選和鑒定早期NSCLC血清的差異表達(dá)蛋白，聯(lián)合傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法，包括Western blot、熒光定量PCR、免疫組化和ELISA，旨在找到可用于NSCLC早期診斷的血清標(biāo)志物。
　　 方法:1.收集經(jīng)手術(shù)治療及病理確診的Ⅰ期NSCLC患者術(shù)前血清作為實(shí)驗(yàn)組;收集經(jīng)手術(shù)治療及病理確診的肺部良性病變患者血清作為良性對(duì)照組;收集同期健康體檢者血清作為正常對(duì)照

3、組。等質(zhì)量混合各組血清標(biāo)本，去除高豐度蛋白質(zhì)后進(jìn)行2-DE分離找到差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測(cè)，鑒定早期NSCLC血清差異表達(dá)蛋白。
　　 2.選取與肺癌/腫瘤關(guān)系密切的差異表達(dá)蛋白作為候選目標(biāo),在3組血清混合樣本中進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，以驗(yàn)證質(zhì)譜鑒定的準(zhǔn)確性，篩選具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)蛋白。
　　 3.將篩選出的差異表達(dá)蛋白通過(guò)熒光定量PCR方法在基因水平上進(jìn)行驗(yàn)證，在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行免

4、疫組化驗(yàn)證和ELISA驗(yàn)證，確定NSCLC早期診斷血清標(biāo)志物。
　　 結(jié)果:1.在3組所有凝膠上均得到了清晰的2-DE蛋白質(zhì)表達(dá)譜，各組凝膠圖像用PDquest軟件進(jìn)行點(diǎn)識(shí)別、背景消除、點(diǎn)匹配及差異蛋白分析。選取肺癌組與另2組比較均P＜0.05的點(diǎn)為差異蛋白點(diǎn)。共有38個(gè)差異點(diǎn)符合以上標(biāo)準(zhǔn)。肺癌組上調(diào)的差異點(diǎn)24個(gè)，下調(diào)的差異點(diǎn)14個(gè)。
　　 2.共挖取38個(gè)差異蛋白點(diǎn)，經(jīng)MALDI-TOF-MS分析，成功鑒定出12種蛋

5、白質(zhì)，其中6種在肺癌組表達(dá)上調(diào)，包括血紅蛋白β鏈、冷凝集素、碳酸酐酶Ⅰ、羧肽酶N催化鏈、補(bǔ)體C3及補(bǔ)體C4A;6種在肺癌組表達(dá)下調(diào)，包括載脂蛋白J、觸珠蛋白、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、補(bǔ)體C8β鏈、補(bǔ)體C1s亞成分及血色素結(jié)合蛋白。
　　 3.選取與肺癌/腫瘤相關(guān)的上調(diào)蛋白血紅蛋白β鏈、碳酸酐酶Ⅰ、補(bǔ)體C3及下調(diào)蛋白載臘蛋白J、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、血色素結(jié)合蛋白，進(jìn)行血清Western blot篩選及驗(yàn)證，結(jié)果上述6種蛋白均出現(xiàn)了清晰的蛋白表

6、達(dá)條帶，證實(shí)了質(zhì)譜鑒定的準(zhǔn)確性。與正常對(duì)照組和良性對(duì)照組比較，肺癌組碳酸酐酶Ⅰ的表達(dá)明顯上調(diào)，轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白的表達(dá)下調(diào)，為尋找肺癌血清標(biāo)志物進(jìn)一步明確了候選蛋白。而載脂蛋白J、補(bǔ)體C3、血紅蛋白β鏈和血色素結(jié)合蛋白的表達(dá)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4.經(jīng)熒光定量PCR、免疫組化和ELISA驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)碳酸酐酶Ⅰ和轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白是非小細(xì)胞肺癌早期診斷標(biāo)志物。
　　 結(jié)論:1.血清標(biāo)本作為一種容易獲取的實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其進(jìn)行研究是有效