應用蛋白質(zhì)組學技術(shù)尋找非小細胞肺癌血清早期診斷標志物的實驗研究.pdf

1、背景及目的:肺癌中約75％-85％為非小細胞肺癌(NSCLC)，由于發(fā)病隱襲，缺乏有效的早期篩查手段，導致大多數(shù)肺癌病人治療難度大、預后差?，F(xiàn)有的腫瘤標記物尚無法應用于肺癌的早期診斷。血清腫瘤標志物對于診斷、判斷預后、療效評價和隨診等方面具有重要意義。因此，尋找肺癌相關的血清標志物是目前研究的熱點之一?；陔p向凝膠電泳（2-DE）和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)為核心的蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)具有高通量、靈敏、自

2、動化的特點，是當今腫瘤標志物研究的重要技術(shù)手段之一。本課題擬應用蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選和鑒定早期NSCLC血清的差異表達蛋白，聯(lián)合傳統(tǒng)實驗方法，包括Western blot、熒光定量PCR、免疫組化和ELISA，旨在找到可用于NSCLC早期診斷的血清標志物。
　　 方法:1.收集經(jīng)手術(shù)治療及病理確診的Ⅰ期NSCLC患者術(shù)前血清作為實驗組;收集經(jīng)手術(shù)治療及病理確診的肺部良性病變患者血清作為良性對照組;收集同期健康體檢者血清作為正常對照

3、組。等質(zhì)量混合各組血清標本，去除高豐度蛋白質(zhì)后進行2-DE分離找到差異表達蛋白點，經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測，鑒定早期NSCLC血清差異表達蛋白。
　　 2.選取與肺癌/腫瘤關系密切的差異表達蛋白作為候選目標,在3組血清混合樣本中進行Western blot驗證，以驗證質(zhì)譜鑒定的準確性，篩選具有統(tǒng)計學意義的差異表達蛋白。
　　 3.將篩選出的差異表達蛋白通過熒光定量PCR方法在基因水平上進行驗證，在蛋白質(zhì)水平上進行免

4、疫組化驗證和ELISA驗證，確定NSCLC早期診斷血清標志物。
　　 結(jié)果:1.在3組所有凝膠上均得到了清晰的2-DE蛋白質(zhì)表達譜，各組凝膠圖像用PDquest軟件進行點識別、背景消除、點匹配及差異蛋白分析。選取肺癌組與另2組比較均P＜0.05的點為差異蛋白點。共有38個差異點符合以上標準。肺癌組上調(diào)的差異點24個，下調(diào)的差異點14個。
　　 2.共挖取38個差異蛋白點，經(jīng)MALDI-TOF-MS分析，成功鑒定出12種蛋

5、白質(zhì)，其中6種在肺癌組表達上調(diào)，包括血紅蛋白β鏈、冷凝集素、碳酸酐酶Ⅰ、羧肽酶N催化鏈、補體C3及補體C4A;6種在肺癌組表達下調(diào)，包括載脂蛋白J、觸珠蛋白、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、補體C8β鏈、補體C1s亞成分及血色素結(jié)合蛋白。
　　 3.選取與肺癌/腫瘤相關的上調(diào)蛋白血紅蛋白β鏈、碳酸酐酶Ⅰ、補體C3及下調(diào)蛋白載臘蛋白J、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、血色素結(jié)合蛋白，進行血清Western blot篩選及驗證，結(jié)果上述6種蛋白均出現(xiàn)了清晰的蛋白表

6、達條帶，證實了質(zhì)譜鑒定的準確性。與正常對照組和良性對照組比較，肺癌組碳酸酐酶Ⅰ的表達明顯上調(diào)，轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白的表達下調(diào)，為尋找肺癌血清標志物進一步明確了候選蛋白。而載脂蛋白J、補體C3、血紅蛋白β鏈和血色素結(jié)合蛋白的表達未見統(tǒng)計學差異。
　　 4.經(jīng)熒光定量PCR、免疫組化和ELISA驗證，發(fā)現(xiàn)碳酸酐酶Ⅰ和轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白是非小細胞肺癌早期診斷標志物。
　　 結(jié)論:1.血清標本作為一種容易獲取的實驗材料，對其進行研究是有效