激光捕獲顯微切割結(jié)合定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選人肺鱗癌早期診斷標(biāo)志物.pdf

1、肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。盡管肺癌的診斷和治療水平已大大提高,但病人的生存率仍然很低,五年生存率低于15％。肺癌患者預(yù)后差的主要原因,一方面是由于肺癌發(fā)病機(jī)理仍然不是很清楚,另方面是缺乏有效的肺癌早期診斷標(biāo)志物。因此,篩選肺癌早期診斷標(biāo)志物對(duì)于提高療效、改善預(yù)后具有重要意義。
　　肺鱗癌起源于支氣管上皮,是一個(gè)多基因參與、多階段的復(fù)雜病理學(xué)過程。在致癌因素作用下,支氣管上皮細(xì)胞的癌變過程一般要經(jīng)過基底細(xì)胞增生、鱗狀化

2、生,進(jìn)而進(jìn)展為不典型增生、原位癌,再發(fā)展為浸潤(rùn)癌。為了篩選新的肺鱗癌早期診斷標(biāo)志物,揭示肺鱗癌癌變的機(jī)制,我們首先采用激光捕獲顯微切割(laser capturemicrodissection,LCM)技術(shù)純化正常支氣管上皮組織、鱗狀化生、不典型增生、原位癌、浸潤(rùn)癌組織,然后再用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)結(jié)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(2D LC-MS/MS)鑒定支氣管上皮癌變過程中各階段的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。本研究共鑒定了102

3、個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì),在這些差異蛋白質(zhì)中,有的在支氣管上皮癌變過程中進(jìn)行性上調(diào),有的在支氣管上皮癌變過程中進(jìn)行性下調(diào),有的呈階段特異性改變。分層聚類分析顯示:102個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)聚集成8個(gè)簇,3大群。GO功能注釋顯示:第1群差異蛋白質(zhì)主要涉及發(fā)育、凋亡、翻譯和代謝等生物學(xué)過程;第2群差異蛋白質(zhì)主要涉及器官發(fā)育、凋亡、對(duì)生物刺激的應(yīng)答和肌動(dòng)蛋白絲束的形成等生物學(xué)過程;第3群差異蛋白質(zhì)主要涉及代謝、細(xì)胞凋亡、運(yùn)輸、細(xì)胞大分子定位、細(xì)胞增殖和體

4、液免疫應(yīng)答等生物學(xué)過程。KEGG通路分析顯示:這三群差異蛋白質(zhì)涉及與腫瘤相關(guān)的一些信號(hào)通路,如MAPK信號(hào)通路,凋亡、細(xì)胞周期、p53信號(hào)通路、以及ErbB信號(hào)通路等。同一群差異蛋白為共同調(diào)節(jié)蛋白,它們?cè)谥夤苌掀ぐ┳兊倪^程中可能具有相似的生物學(xué)功能,并可能通過這些信號(hào)通路發(fā)揮作用,從而促使支氣管上皮癌變。
　　在102個(gè)差異蛋白質(zhì)中,HSPB1的表達(dá)在支氣管上皮癌變過程中呈進(jìn)行性上調(diào),GSTP1和CKB的表達(dá)在支氣管上皮癌變過程

5、中呈進(jìn)行性下調(diào)。因此,我們選擇HSPB1、GSTP1和CKB進(jìn)行深入研究,采用Western blotting檢測(cè)這三個(gè)蛋白質(zhì)在支氣管上皮癌變過程中各階段組織中的表達(dá),結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致;采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)這三個(gè)蛋白質(zhì)在石蠟包埋的正常支氣管上皮、鱗狀化生、不典型增生、原位癌、浸潤(rùn)癌組織標(biāo)本中的表達(dá),并且采用ROC曲線分析評(píng)估它們?cè)缙谠\斷肺鱗癌的能力,結(jié)果顯示:三個(gè)蛋白組合判別正常支氣管上皮和癌前病變的敏感性和特異性分別為96

6、％和92％、判別正常支氣管上皮和肺鱗癌的敏感性和特異性分別為99％和98％、判別癌前病變和肺鱗癌的敏感性和特異性分別為92％和91％,結(jié)果表明:HSPB1、GSTP1和CKB聯(lián)合檢測(cè)能區(qū)分正常支氣管上皮、癌前病變和肺鱗癌。
　　為探討GSTP1在肺鱗癌發(fā)病中的作用,我們以永生化的人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE為研究對(duì)象,采用siRNA干擾技術(shù)建立了穩(wěn)定沉默GSTP1表達(dá)的16HBE細(xì)胞系(16HBE/PLO.1-GSTP1-sNRN

7、A)及空白載體轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞系:采用MTT細(xì)胞增殖測(cè)定、平板集落形成實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和Hoechest33258染色等觀察GSTP1表達(dá)沉默對(duì)苯并芘(B[a]P)轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示:與對(duì)照細(xì)胞比較,在B[a]P的誘導(dǎo)下,GSTP1表達(dá)沉默的16HBE細(xì)胞的增殖速度明顯增快、平板集落數(shù)和軟瓊脂集落數(shù)均顯著增加、細(xì)胞凋亡率顯著減少。結(jié)果表明:GSTP1表達(dá)沉默顯著增加16HBE細(xì)胞對(duì)B[a]P誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的敏

8、感性。提示GSTP1表達(dá)下調(diào)參與了支氣管上皮的癌變,GSTP1表達(dá)下調(diào)有望成為預(yù)測(cè)吸煙人群對(duì)肺鱗癌易感性的指標(biāo)。
　　本研究采用LCM結(jié)合定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)開展支氣管上皮癌變各階段組織的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究,鑒定了102個(gè)支氣管上皮癌變相關(guān)的蛋白質(zhì),深入挖掘了102個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能以及涉及的信號(hào)通路;發(fā)現(xiàn)HSPB1、GSTP1和CKB聯(lián)合檢測(cè)對(duì)正常支氣管上皮、肺鱗癌癌前病變和肺鱗癌組織具有良好的判別能力,HSPB1、GS