基于蛋白質(zhì)組學技術(shù)對先天性心臟畸形產(chǎn)前診斷蛋白質(zhì)標志物的篩查研究.pdf

1、目的：
　　先天性心臟畸形(congenital heart defects，CHDs)是最常見的先天畸形之一，發(fā)病率約為活產(chǎn)嬰兒的1.9％-7.5％，在死產(chǎn)或自然流產(chǎn)的胎兒中比例更高。我國每年約有10萬-15萬CHDs患兒出生，為新生兒時期的主要死亡原因之一，對患兒及其親屬乃至整個社會都造成沉重的負擔。
　　因此，CHDs的早期診斷以及發(fā)生機制的研究，對于開展CHDs的預防或產(chǎn)前干預，具有十分重要的意義。目前，臨床工作中尚

2、沒有產(chǎn)前篩查CHDs的分子標志物，CHDs的產(chǎn)前診斷主要依賴于產(chǎn)前超聲檢查。然而，胎兒超聲心動圖僅僅在一些產(chǎn)前診斷中心得以開展，只有少部分高危妊娠孕婦能夠得到檢查，并且診斷準確率受操作者主觀診斷能力的影響較大。而且超聲對CHDs檢出時間較晚，許多孕婦發(fā)現(xiàn)CHDs時孕周較大，且很多復雜心臟畸形是生后手術(shù)難以矯正的。在孕婦的外周血中篩選出畸形相關(guān)標志物被公認為產(chǎn)前診斷的最理想方式。首先，它可以避免傳統(tǒng)的有創(chuàng)產(chǎn)前診斷方法（如羊水穿刺、臍血穿刺

3、等）帶來的風險;其次，它可以作為一種篩查手段在基層醫(yī)院得以開展，結(jié)果異常的建議進一步做超聲心動圖檢查;再次，這種檢查手段有可能早期發(fā)現(xiàn)CHDs，這為早期臨床決策及靶向治療提供了重要依據(jù)。
　　以蛋白質(zhì)組學為基礎，在孕婦的血清、羊水以及代謝產(chǎn)物中篩選出妊娠相關(guān)分子標志物方面的研究在過去幾年中取得了顯著進展。目前，蛋白質(zhì)組學技術(shù)在產(chǎn)前主要被應用于染色體異常胎兒標志物的篩查，對胎兒結(jié)構(gòu)畸形產(chǎn)前標志物篩查的研究甚少。本研究中，我們結(jié)合了非

4、靶向蛋白質(zhì)組學技術(shù)——同位素標記相對和絕對定量技術(shù)(isobaric tag for relative and absolute quantitation，iTRAQ)與靶向蛋白質(zhì)組學技術(shù)——多反應監(jiān)測質(zhì)譜技術(shù)(multiple reaction monitoring massspectrometry，MRM-MS)比較CHD孕婦與正常孕婦外周血中的蛋白表達差異，并利用經(jīng)典的ELISA技術(shù)進行大樣本驗證，篩選出CHD孕婦產(chǎn)前無創(chuàng)診斷的蛋

5、白質(zhì)標志物。
　　方法：
　　一、孕婦血清與胎兒心臟標本收集
　　1、共收集正常孕婦、CHD胎兒孕婦、其它結(jié)構(gòu)畸形胎兒孕婦以及正常孕齡期婦女外周血血清420例。
　　(1) CHD組:2011年9月至2014年12月于中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心診斷為胎兒單純先天性心臟畸形孕婦外周血血清180例，孕周22-26周;
　　(2)正常對照組:選擇孕齡和年齡均與CHD組相匹配（22-26周）的正常孕婦90

6、例作為對照組;
　　(3)其它孕周組:選擇年齡與對照組相匹配的正常孕婦不同孕周外周血血清80例，其中8-10周、16-19周、32-34周、38-40周各20例。
　　(4)未孕組:年齡與對照組相匹配的孕齡期婦女（既往身體健康，無妊娠史）外周血血清20例。
　　(5)16-19周CHD組:在16-19周診斷為CHDs的孕婦外周血血清10例。
　　(6)其它系統(tǒng)畸形:選取周齡、孕婦年齡與對照組相匹配的單純唇腭裂、單

7、純神經(jīng)管畸形、單純?nèi)旧w異常、其它單一系統(tǒng)畸形（單純消化系統(tǒng)畸形4例、單純泌尿系統(tǒng)畸形4例、單純肢體畸形2例）孕婦外周血血清各10例。
　　所有孕婦均為單胎妊娠，既往身體健康，不合并妊娠高血壓、糖尿病等其它系統(tǒng)疾病。孕婦均簽署知情同意書，于清晨7:00-8:00抽取空腹靜脈血5ml，4℃靜置1h，3000 rpm離心10min，取上清，每管200ul分裝，-80℃保存。
　　2、共收集胎兒心臟組織8例
　　(1)CHD

8、組:22-26周CHD胎兒心臟大體標本4例，
　　(2)正常對照組:選擇與CHD組孕周、孕婦年齡、胎兒性別相匹配的心臟發(fā)育正常的胎兒心臟組織4例。所有心臟組織-80℃保存。
　　二、同位素標記相對和絕對定量技術(shù)(iTRAQ)對差異蛋白質(zhì)的篩選
　　不同亞型的先心病可能呈現(xiàn)不同的蛋白質(zhì)表達譜，因此在標志物的發(fā)現(xiàn)階段，我們設置了4個先心病亞型組和一個對照組。這樣既可以篩選出先心病特異的標志物，也可以觀察到不同亞型之間表達是

9、否有差異，避免不同亞型先心病混合后對某些蛋白質(zhì)表達的掩蓋。4組先心病樣本中，每組10例樣本混合，前3組是3種比較常見的先心?。ǚ迨纤穆?lián)征，室間隔缺損，共同動脈干），另外一組是幾種少見的不同亞型先心病的混合。對照組為10例正常孕婦血清混合?；旌虾蟮臉颖居肞roteo miner試劑盒進行血清高豐度蛋白去除，提取蛋白;對提取后的蛋白樣品進行還原烷基化處理，打開二硫鍵以便后續(xù)步驟充分酶解蛋白;用Brand ford法進行蛋白的濃度測定;SD

10、S（十二烷基磺酸鈉）-PAGE;取等量蛋白Trypsin酶解;用iTRAQ試劑標記肽段;將標記后的肽段進行等量混合;對混合后的肽段使用強陽離子交換色譜（Strong Cation Exchange Choematography，SCX）進行預分離;最后進行液相串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography coupled with tandemmassspectrometry，LC-MS/MS)分析。
　　三、生物信息學分析

11、及候選標志物的預測
　　1、生物信息學分析
　　應用Mascot檢索軟件、GO注釋、COG注釋、Pathway代謝通路注釋、多樣品間表達模式聚類分析等生物信息學方法對差異蛋白進行功能分析。
　　2、候選標志物的選擇標準
　　(1)在CHD與正常對照組血清之間差異顯著，表達差異在1.5倍以上。
　　(2)差異重復性好，在不同亞型CHD中穩(wěn)定表達。
　　(3)質(zhì)譜檢測信號強，信噪比高。
　　(4)功

12、能檢索提示該蛋白應具有較重要的生理功能，在胚胎發(fā)育及代謝過程中具有一定的生物學作用。
　　四、多反應監(jiān)測質(zhì)譜技術(shù)(MRM-MS)對差異蛋白質(zhì)的驗證
　　1、確定目標蛋白質(zhì)
　　根據(jù)生物信息學結(jié)果確定目標蛋白質(zhì)，并根據(jù)目標蛋白的已知信息預測目標蛋白的代表肽段。
　　2、預測可行的transitions。
　　在選擇肽段的transition時，首要條件要保證所選肽段在樣本背景中能唯一代表目標蛋白。同時，其它選

13、擇條件如肽段長度一般為6-15氨基酸、母離子+2或+3價，m/z小于1000，子離子為y離子、肽段無轉(zhuǎn)錄后或化學修飾、無漏切位點等都是選擇最優(yōu)的transitions需要綜合考慮的條件。
　　結(jié)果：
　　一、iTRAQ技術(shù)對差異蛋白質(zhì)的鑒定
　　應用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學方法鑒定差異蛋白，在孕婦外周血血清中共鑒定到蛋白質(zhì)606個，表達差異在1.5倍以上的蛋白質(zhì)47個，其中23個表達上調(diào)，24個表達下調(diào)，這些差異蛋白部

14、分在所有亞型組中均差異表達，部分在一種或幾種亞型組中差異表達。這47個差異蛋白的功能主要涉及到應激反應、脂類代謝、發(fā)育過程、細胞構(gòu)成等生物過程。
　　二、MRM-MS技術(shù)對差異蛋白質(zhì)的驗證
　　在iTRAQ技術(shù)鑒定得到的47種差異蛋白中，LMNA，TPM4，F(xiàn)LNA，MYH9，APOC1，PF4V1，SAA2，SAA4，HP，ACTG1和NRX2B11種蛋白在3種以上亞型組中均差異表達，我們應用MRM-MS技術(shù)對這11種蛋白

15、進行進一步的驗證，這樣得到的標志物更有希望診斷不同亞型先心病。
　　應用MRM技術(shù)成功對11種蛋白質(zhì)中的9種進行相對定量，另外兩種蛋白（FLNA和ACTG1）因為信號強度較低不能進行準確定量。驗證實驗在一個獨立樣本中完成，CHD組22例，對照組20例，每個樣品重復檢測3次。MRM結(jié)果顯示CHD組中LMNA，TPM4明顯下調(diào)，APOC1表達明顯上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學意義，這三種蛋白的驗證結(jié)果與iTRAQ蛋白質(zhì)組學篩選的結(jié)果一致。MY

16、H9，PF4V1，HP，SAA4在MRM結(jié)果中差異不明顯;SAA2，NRX2B在CHD組中表達明顯下調(diào)，這與iTRAQ篩選得到的結(jié)果相反。
　　三、ELISA技術(shù)對候選標志物的驗證
　　我們應用ELISA技術(shù)對MRM進一步篩選得到的候選標志物在一個獨立的相對較大的樣本中進行進一步的驗證，MRM技術(shù)沒能準確定量的兩種蛋白質(zhì)FLNA和ACTG1也被納入ELISA的驗證實驗。
　　結(jié)論：
　　1、本實驗首次將定量蛋白質(zhì)

17、組學iTRAQ技術(shù)應用于先天性心臟畸形產(chǎn)前診斷標志物的研究當中。我們應用該技術(shù)成功獲得了CHD胎兒孕婦血清差異表達蛋白質(zhì)譜。
　　2、我們結(jié)合靶向蛋白質(zhì)組學MRM-MS技術(shù)和經(jīng)典ELISA技術(shù)對差異蛋白進行驗證，得到了一組蛋白質(zhì)標志物(LMNA，F(xiàn)LNA，TPM4，ACTG1)在產(chǎn)前診斷CHDs中具有較高的敏感性和特異性。這些蛋白質(zhì)均為細胞骨架蛋白，提示這些骨架蛋白在心臟發(fā)育過程中可能發(fā)揮了重要作用。
　　3、LMNA作為單