補陽還五湯對博萊霉素所致大鼠特發(fā)性肺纖維化的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　基于促纖維化生成的關鍵介質HMGB1探討補陽還五湯治療博來霉素致大鼠特發(fā)性肺纖維化藥效學作用機制。
　　方法：
　　1.采用體重200±20g的SD雄性大鼠144只隨機分為空白對照組、模型組、強的松組、補陽還五湯高、中、低劑量組，每組24只。除空白組外其余各組均采用一次性氣管注射博來霉素法誘導肺纖維化模型。造模后24h給予相應藥物，各組分別于第7、14、28天隨機抽取8只大鼠進行股動脈放血處死，收集支氣管肺

2、泡灌洗液（Broncho alveolar fluid，BALF）和肺組織，采用HE、Masson染色法觀察肺組織肺泡炎、纖維化程度，酶聯免疫法（ELISA法）檢測肺泡灌洗液中早期炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和晚期炎性因子HMGB1的水平，逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR法）檢測肺組織HMGB1、TLR2mRNA的表達，Western-blot法檢測肺組織中HMGB1、α-SMA的含量，免疫組化染色法（鏈霉素親和素一過氧化物

3、酶，SABC法）檢測肺組織切片HMGB1、α-SMA蛋白的分布及表達。2.從中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心購置A549，培養(yǎng)傳至第三代后分別根據實驗需要種于不同的培養(yǎng)皿中，收集對數生長期細胞用于實驗。加入以DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋的補陽還五湯溶液，加入HMGB1蛋白刺激培養(yǎng)24h收獲上清，分裝后予-80℃凍存?zhèn)溆?；條件一致，加入以DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋的補陽還五湯溶液，加入HMGB1蛋白分別于刺激0、6、24、72h提取

4、細胞總蛋白。Western-blot法檢測A549細胞蛋白中STAT3、P-STAT3的表達。
　　結果：
　　1.一般情況：空白組大鼠形體壯碩，反應靈敏，皮毛光滑柔順，食量正常。模型組大鼠表現出精神萎靡，眼光呆滯，反應遲鈍，呼吸喘促，個別口鼻出現紅色分泌物，少動，皮毛干枯無光澤，弓背蜷縮，進食量較正常組減少，體重增長緩慢。其余各給藥組大鼠精神較好，反應較為靈敏，呼吸較平穩(wěn)，皮毛光澤度良好。隨時間的推進，活動量、進食量下降等

5、程度均有不同程度的改善。
　　2.病理形態(tài)學：①HE染色：空白對照組大鼠肺組織結構清晰，未見明顯形態(tài)學改變；與空白對照組相比，模型組大鼠的肺泡結構均有不同程度的破壞，有炎性細胞的浸潤和膠原纖維的增生；與模型組相比，各給藥組的肺泡炎及肺纖維化程度在不同時間點均有不同程度的改善。②Masson染色空白組組大鼠支氣管壁膠原層較薄，肺泡區(qū)有少量染成淺藍色的膠原纖維分布。模型組大鼠第7d肺泡間明顯增寬，在支氣管壁、血管壁以及肺泡間隔均可見染

6、成藍色的膠原纖維；第14d各級支氣管及血管外壁、增厚的肺泡隔內均可見藍色膠原纖維；第28d在細支氣管、低血管外膜和纖維化實變區(qū)可見大量藍色膠原纖維增生，彌漫性肺纖維化生成。強的松組與補陽還五湯各劑量組均能減輕肺纖維化。
　　3.TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1的含量：①TNF-α：與空白組比較，各時間點模型組大鼠肺泡灌洗液中（BALF）中TNF-α含量升高（P＜0.05）。在28天TNF-α含量下降，與7、14天比較差

7、異具有顯著性（P＜0.05）；與模型組比較，各時間點強的松組和補陽還五湯高、中、低劑量組均降低大鼠肺泡灌洗液中（BALF）中TNF-α含量（P＜0.05）；與強的松組比較，第7、14天補陽還五湯各劑量組有明顯差異（P＜0.05）；補陽還五湯各劑量組之間比較，各時間點高劑量組與低、中劑量組之間有差異（P＜0.05）②IL-1β：與空白組比較，各時間點模型組大鼠肺泡灌洗液中（BALF）中IL-1β含量升高（P＜0.05）。其IL-1β含量呈

8、進行性降低趨勢，實驗的第7天達到高峰，以后逐漸下降，但仍然處于較高水平。與模型組比較，各時間點強的松組和補陽還五湯高、中、低均降低大鼠肺泡灌洗液中（BALF）中IL-1β含量（P＜0.05）；與強的松組相比，第7天補陽還五湯高、中、低劑量組具有顯著性差異（P＜0.05），與強的松組相比，第14、28天補陽還五湯各劑量組無明顯差異（P＞0.05）。補陽還五湯各劑量組之間無明顯差異（P＞0.05）③IL-6：空白組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液

9、中（BALF）中IL-6含量升高（P＜0.05）。模型組各時間點比較，第14、28天與第7天比有差異（P＜0.05），其IL-6含量呈進行性降低趨勢。與模型組比較，各時間點強的松組和補陽還五湯高、中、低均降低大鼠肺泡灌洗液中（BALF）中IL-6含量（P＜0.05）；與強的松組相比，第7天高、中、低劑量組具有顯著性差異（P＜0.05）。第14、28天補陽還五湯各劑量組無明顯差異（P＞0.05）。補陽還五湯各劑量組之間比較無明顯差異（P＞

10、0.05）④HMGB1：與空白組比較，各時間點模型組大鼠肺泡灌洗液中（BALF）中HMGB1含量升高（P＜0.05），模型組各時間點之間比較，無明顯差異（P＞0.05）；與模型組比較，各時間點強的松組和補陽還五湯高、中、低均降低大鼠肺泡灌洗液中（BALF）中HMGB1含量（P＜0.05）；與強的松組相比，在第7、14、28天補陽還五湯各劑量組均有明顯差異（P＜0.05）。
　　4.HMGB1、α-SMA的表達：①HMGB1表達與空

11、白組比較，各時間點模型組大鼠肺組織HMGB1的表達升高（P＜0.01）。模型組各個時間點比較，無明顯差異（P＞0.05）；與模型組比較，強的松組和補陽還五湯高、中、低在各個時間點均降低肺組織HMGB1的過度表達（P＜0.05）；與強的松組相比，第7、14、28天補陽還五湯各劑量組均有明顯差異（P＜0.05）。②α-SMA的表達與空白組比較，各時間點模型組大鼠肺組織α-SMA的表達升高（P＜0.01）。模型組各個時間點比較無明顯差異（P＞

12、0.05）。與模型組比較，各時間點強的松組和補陽還五湯高、中、低均降低肺組織α-SMA的過度表達（P＜0.05）；與強的松組相比，第28天補陽還五湯各劑量組有明顯差異（P＜0.05）。
　　5.HMGB1、TLR2mRNA的表達：①HMGB1mRNA的表達空白組內各時間點HMGB1mRNA的表達無明顯差異（P＞0.05），與空白組比較，各時間點模型組大鼠肺組織HMGB1mRNA的表達升高（P＜0.05），模型組各個時間點比較，無明

13、顯差異（P＞0.05）；與模型組比較，各時間點強的松組和補陽還五湯高、中、低均降低肺組織HMGB1mRNA的過度表達（P＜0.05）；與強的松組相比，在第14、28天補陽還五湯各劑量組有明顯差異（P＜0.05）；②TLR2mRNA的表達空白組內各時間點TLR2mRNA的表達無明顯差異（P＞0.05），與空白組比較，各時間點模型組大鼠肺組織TLR2mRNA的表達升高（P＜0.05）；模型組各個時間點之間比較無明顯差異（P＞0.05）；與模

14、型組比較，強的松組和補陽還五湯高、中、低均降低肺組織TLR2mRNA的過度表達（P＜0.05）；補陽還五湯各劑量組與強的松組相比無明顯差異（P＞0.05）。
　　6.STAT3、P-STAT3的表達：與正常組比較，在HMGB1刺激下STAT3、P-STAT3的表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，20％補陽還五湯含藥血清能夠抑制A549STAT3、P-STAT3的表達（P＜0.05）。
　　結論：
　　1.補陽還

15、五湯能夠改善BLM所致特發(fā)性肺纖維化大鼠的肺泡炎和肺纖維化瘢痕形成。
　　2.補陽還五湯能夠降低BLM所致的特發(fā)性肺纖維化大鼠支氣管肺泡灌洗液炎性指標TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、HMGB1的濃度值，這可能是其發(fā)揮抗IPF作用的機制之一。
　　3.補陽還五湯能夠有效抑制肺組織HMGB1、TLR2mRNA的表達，補陽還五湯能夠抑制肺組織HMGB1、α-SMA蛋白的表達，補陽還五湯含藥血清能夠抑制STAT3、P-S