辣椒再生體系的建立及Bt與Ca-eIF4E基因轉(zhuǎn)化辣椒.pdf

1、辣椒(CapsicumannuumL.)是一種重要的蔬菜作物，在世界各地廣泛栽培。然而，隨著辣椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其病蟲害也逐年加重，并造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。植物基因工程的快速發(fā)展為辣椒遺傳改良提供了一條嶄新而有效的方法。通過(guò)抗病蟲目的基因的導(dǎo)入，獲得轉(zhuǎn)基因抗病蟲植株，從中選育出抗病蟲、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的辣椒新品種。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外這方面的研究很多，但成功例子很少。 辣椒抗病蟲基因工程發(fā)展的最大障礙是辣椒離體再生困難，以致轉(zhuǎn)化率太低。本研究以7

2、個(gè)辣(甜)椒品種為試材，分別就基因型、外植體類型、苗齡、培養(yǎng)基成分等對(duì)辣椒離體再生的影響進(jìn)行了較為系統(tǒng)而深入的探討，建立辣椒的再生體系。在此和前人研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)外源基因轉(zhuǎn)化辣椒的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)條件的摸索，建立辣椒的遺傳轉(zhuǎn)化體系。 cryIA(c)來(lái)源于蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物對(duì)鱗翅目昆蟲具有特異的毒殺作用而對(duì)高等動(dòng)物和人無(wú)害。通過(guò)調(diào)控真核翻譯起始因子4E(eIF4E)可以增

3、強(qiáng)植物對(duì)病毒的抗性。本研究通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將cryIA(c)與辣椒eIF4E編碼基因Ca-eIF4E導(dǎo)入辣(甜)椒，通過(guò)PCR檢測(cè)，初步證實(shí)兩個(gè)基因已分別整合到辣椒基因組中。 本研究的主要結(jié)果如下：1.對(duì)于辣椒不定芽的誘導(dǎo)，外植體宜選用子葉而非下胚軸；不同苗齡的子葉再生能力差異大，剛充分展開時(shí)的子葉再生能力最強(qiáng)，為剪取外植體的最佳時(shí)期；不同基因型其子葉再生能力不同，7個(gè)供試?yán)?甜)椒品種中，以楚風(fēng)再生能力最強(qiáng)；不同的激素組合

4、及配比對(duì)子葉誘導(dǎo)不定芽有不同的影響。6-BA+IAA效果最好，6-BA+PAA次之，Zt最差。其中6-BA5.0mg/L+IAA0.2mg/L的激素配比可使楚風(fēng)、蘇椒五號(hào)、湘椒21號(hào)與茄門甜椒四個(gè)辣(甜)椒品種的不定芽誘導(dǎo)頻率達(dá)到100％；Ag+的添加改變子葉分化的極性；隨著Ag+濃度的增加極性作用增強(qiáng)；AgNO3的極性作用強(qiáng)于螯合銀離子(silverthiosulfate，STS)；AgNO3對(duì)不定芽的誘導(dǎo)產(chǎn)生抑制作用；STS則因其濃

5、度、辣椒品種而異會(huì)促進(jìn)或抑制不定芽的誘導(dǎo)，。 2.不定芽誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)不定芽的伸長(zhǎng)有一定的影響，誘導(dǎo)21d的不定芽，其伸長(zhǎng)頻率明顯的高于誘導(dǎo)14d的不定芽；GA3的添加有利于不定芽的伸長(zhǎng)。不定芽的伸長(zhǎng)百分率隨著GA3濃度的增加而增加，但當(dāng)GA3濃度增加到3.0mg/L時(shí)反而抑制不定芽的伸長(zhǎng)，GA3的適合濃度為1.0～2.0mg/L；不定芽誘導(dǎo)期與伸長(zhǎng)期的基本激素組合相同與否對(duì)不定芽的伸長(zhǎng)有一定的影響，但總的來(lái)說(shuō)Zt+GA3效果最好，

6、6-BA+IAA+GA3次之，6-BA+PAA+GA3最差；B5有機(jī)成分在辣椒不定芽的伸長(zhǎng)中效果優(yōu)于MS有機(jī)成分的；辣椒幼苗莖葉提取液對(duì)不定芽的伸長(zhǎng)沒有促進(jìn)作用。 3.生長(zhǎng)素IAA、IBA與NAA對(duì)再生苗的生根有影響，IBA上長(zhǎng)出的根最好；1/2MS+0.5mg/LIBA為最佳生根培養(yǎng)基。 4.使用RT-PCR方法克隆得到Ca-eIF4E基因。 5.50mg/L的卡那霉素(Kanamycin，Km)可完全抑制蘇椒

7、五號(hào)與茄門甜椒的不定芽分化，而楚風(fēng)、汴紅一號(hào)與特大甜椒則75m/LKm才能完全抑制其不定芽的分化；頭孢霉素(Cefotaxime，Cef)與羧芐青霉素(Carbenicillin，Cb)對(duì)不定芽的誘導(dǎo)作用與Ag+作用相似，其中Cef的極性作用強(qiáng)于Cb。 6.農(nóng)桿菌感染前辣椒轉(zhuǎn)化外植體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，感染后共培養(yǎng)有利于子葉遺傳轉(zhuǎn)化效率的提高，其最佳時(shí)間分別為1d和3d；對(duì)于通過(guò)斬首再生的轉(zhuǎn)化，Km明顯的抑制根系的生長(zhǎng)，因此建議不使用K