基于栽培辣椒和野生辣椒的全基因組測序揭示辣椒屬的馴化與特異性.pdf

1、為了深入研究辣椒的特異性和馴化，本研究開展辣椒的全基因組測序。測序的辣椒材料為遵義市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育的一年生辣椒‘遵辣1號’及其來自墨西哥的野生材料‘Chiltepin’，并對其他18個辣椒栽培材料和2個野生/半野生辣椒材料進行了重測序。通過辣椒基因組、轉(zhuǎn)錄組、群體多樣性、小RNA和次級代謝產(chǎn)物等方面的研究，得到如下結(jié)果:
　　1.完成辣椒全基因組測序，獲得兩個辣椒材料基因組的精細序列圖譜
　　對一年生辣椒‘遵辣1號’和其

2、野生材料“Chikepin”分別進行了146.43x（全基因組覆蓋率，下同）和96.37x的全基因組測序，最后分別獲得99.78x和66.73x的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)。通過復(fù)雜的生物信息學(xué)分析和測序數(shù)據(jù)的組裝，兩個辣椒材料基因組的組裝大小分別為3.35 Gb和3.48 Gb?！窭?號’的scaffold N50和contig N50分別為1.22 Mb和55.43kb;‘Chiltepin’的scaffold N50和contig N50分

3、別為445.59 kb和52.23kb。通過高密度遺傳圖譜的協(xié)助組裝，獲得均超過80％測序數(shù)據(jù)都錨定到相應(yīng)染色體上的2個精細序列圖譜。
　　2個基因組的完整序列和基因組注釋信息公布在自建的辣椒基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站上(release2.0，http://peppersequence.genomics.cn)，供全球辣椒研究者或者相關(guān)研究者參考。
　　2.重復(fù)序列和基因組的擴張
　　本研究采用同源搜索和從頭預(yù)測相結(jié)合的方法鑒定

4、‘遵辣1號’和‘Chiltepin’基因組中的轉(zhuǎn)座元件，檢測到Ⅰ型和Ⅱ型轉(zhuǎn)座子，前者有LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（主要包括copia類和gypsy類）、長散在核重復(fù)序列(long interspersed nuclear elements，LINE)類、短散在核重復(fù)序列(Short interspersed nuclear elements，SINE)類等，后者有hat、En-Spam、Mudra及相關(guān)的序列等。
　　上述轉(zhuǎn)座元件的分析表

5、明，不同類型的轉(zhuǎn)座元件占辣椒基因組大小的81％(約2.7 Gb)，顯著高于番茄、馬鈴薯基因組中轉(zhuǎn)座元件所占的比重（約61％）。大部分植物中已發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座元件均在辣椒基因組中存在，包括占基因組70.3％的長末端重復(fù)序列(LTR)轉(zhuǎn)座子和4.5％ DNA轉(zhuǎn)座子。這表明LTR轉(zhuǎn)座子可能導(dǎo)致了辣椒基因組的擴增，遠大于其在番茄（占基因組的50.3％）、馬鈴薯（占基因組的47.2％）和葡萄（占基因組的46.2％）中對基因組的貢獻，與玉米基因組中LTR

6、轉(zhuǎn)座子的貢獻（占基因組的75％）非常相似。在LTR轉(zhuǎn)座子中，權(quán)重最高的是Gypsy類(54.5％)和Copia類(8.6％)轉(zhuǎn)座子。這和單子葉植物如小麥基因組中LTR轉(zhuǎn)座子的分布不同，后者Copia類轉(zhuǎn)座子是DNA重復(fù)序列中比例最高的。在辣椒所有鑒定的轉(zhuǎn)座元件中，與番茄、馬鈴薯相比較，分別有23.1％和16.2％是祖先的重復(fù)序列，它們在番茄、馬鈴薯與辣椒分化之前就已經(jīng)存在。在進化分支上，辣椒屬和番茄屬分開后，發(fā)生了基因組的擴增，新產(chǎn)生了

7、一些特異的轉(zhuǎn)座元件，它們占基因組的50.8％，其中LTR轉(zhuǎn)座子是其最主要的類型。
　　為分析辣椒基因組的擴增，利用序列分歧分析估算所有LTR轉(zhuǎn)座子的插入時間。分析發(fā)現(xiàn)，從300萬年前開始，辣椒屬的基因組逐漸有LTR轉(zhuǎn)座子的插入;從100萬年前開始，LTR轉(zhuǎn)座子的插入活性逐漸增強，在約30萬年前時達到峰值，這表明茄科植物進化過程中辣椒屬基因組的擴增是近期發(fā)生的事件。進一步分析Copia和Gypsy類的插入時間和系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果和基于

8、所有LTR轉(zhuǎn)座子序列分歧分析的結(jié)果相近，這進一步證實了上述推論。自茄科植物分化后，Gypsy類轉(zhuǎn)座子比Gypsy類具有更強的插入活性，并在辣椒基因組中占有最高的比例。
　　3.基因注釋和基因的轉(zhuǎn)錄
　　為注釋‘遵辣1號’和‘Chiltepin’的基因，通過對代表不同發(fā)育時期和不同組織的30個樣品的轉(zhuǎn)錄組進行測序，共獲得90.5 Gb高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)?！窭?號’和‘Chiltepin’采用證據(jù)支持和從頭預(yù)測（de novo）

9、相結(jié)合的方法分別預(yù)測得到35，336和34，476個高度可信的蛋白編碼基因，獲得的基因數(shù)和番茄相近，略低于馬鈴薯、水稻或大白菜，高于其他五個物種（擬南芥、番木瓜、葡萄、西瓜、黃瓜）。兩個物種的基因在著絲粒附近的密度相對較低，但轉(zhuǎn)座元件在這些區(qū)域的密度卻很高，這表明重復(fù)序列在染色體上呈不均勻的散在分布。
　　通過對‘遵辣1號’花蕾的長非編碼RNA測序，獲得2，717，180個序列片段。用自主開發(fā)的軟件鑒定得到6，527個lncRNA

10、s。根據(jù)其所處的位置，將這些lncRNA細分為5，976基因間lncRNA、222個內(nèi)含子重疊的lncRNA和329個雙向lncRNA。
　　采用生物信息學(xué)共鑒定到176個miRNA基因候選位點，其中有141個候選miRNA基因?qū)?yīng)于141個成熟的miRNAs，屬于35個保守的miRNA家族;其他為辣椒特異的miRNA，歸為29個新的家族。基于上述鑒定的176個miRNA（64個家族），采用生物信息學(xué)的方法共預(yù)測這些miRNAs的

11、1，104個靶基因，其中78％具有假定的功能。這些靶基因的結(jié)構(gòu)域的分析表明，32個miRNA家族通過靶向作用編碼轉(zhuǎn)錄因子的mRNAs，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控起著重要的作用。
　　4.茄科植物的進化
　　利用OrthoMCL軟件，鑒定了辣椒、番茄、馬鈴薯和擬南芥的基因家族。結(jié)果顯示，它們共同擁有10，279個基因家族，這些與生命攸關(guān)的重要基因（常被進化生物學(xué)家稱為“核心基因”）古老而保守，以“生命的糧食”形式在物種之間代代相傳。辣椒共有

12、17，671基因家族，每個家族至少含有一個直系同源基因，其中的1，257個基因家族（含有3，143個基因）是辣椒特有的。這些特有基因主要富集在對生物刺激的響應(yīng)、蛋白質(zhì)水解等基因本體分類，從而使辣椒適應(yīng)廣泛的氣候環(huán)境。
　　我們還從葡萄、番木瓜、辣椒、番茄、馬鈴薯和擬南芥6個物種中鑒定了5，231個單拷貝的直系同源基因。以這些基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明，雙子葉植物分化出茄科的時間幾乎在15，600萬年之前，大概在單子葉植物和雙子

13、葉植物分開后不久。辣椒和馬鈴薯、番茄分開的時間大約在3600萬年以前。
　　通過對辣椒與番茄、馬鈴薯基因組之間的比較分析，發(fā)現(xiàn)辣椒與后兩者之間分別存在1，052和799個大的共線性區(qū)域，同時也分別發(fā)生了612和430個染色體易位，這些易位幾乎分布在所有12條染色體上，另外還分別存在468和367個染色體的倒位。
　　通過辣椒與葡萄基因組之間的精細分析，發(fā)現(xiàn)辣椒基因組曾發(fā)生了全基因組的三倍化事件，三倍化區(qū)域的序列占基因組的39

14、％，達到1.32 Gb;三倍化區(qū)域的基因數(shù)目達到23，017個，占總基因數(shù)目的65％。在進化的過程中，祖先基因中有5，726個基因經(jīng)全基因組復(fù)制后所產(chǎn)生的3個拷貝僅保留一個拷貝，有723個基因保留了2個拷貝，有45基因保留了3個拷貝，另外有2，675個基因的3個拷貝竟然完全丟失。
　　基于組裝結(jié)果，通過物種間比較共線性片段內(nèi)旁系基因的4DTv(four-folddegenerate sites)突變率估算了基因組的復(fù)制，發(fā)現(xiàn)在0.

15、48和0.3處分別出現(xiàn)了辣椒、番茄和馬鈴薯之間共同的峰，由此估計出辣椒的祖先與葡萄的分化發(fā)生在大約8，900萬年前，經(jīng)歷了第一次三倍化的復(fù)制過程，另一次則發(fā)生在6000萬年前，巧合的是——這段時間正是許多恐龍物種滅絕的時期?；蛟S這兩次基因組復(fù)制事件正是辣椒、番茄和馬鈴薯的祖先在該時期得以幸存的原因。另外，辣椒還有一次特異復(fù)制，由此估計辣椒與番茄、馬鈴薯的分化發(fā)生在大約2，000萬年前，沒有證據(jù)表明在此之后經(jīng)歷了全基因組的復(fù)制，進一步證實

16、了轉(zhuǎn)座子元件的擴張是導(dǎo)致辣椒基因組擴增的主要原因。
　　5人工選擇的分子印跡
　　對18個辣椒栽培材料、2個野生/半野生材料進行重測序（測序深度為20x～30x，覆蓋度83％以上）后，共獲得845，020 Gb的數(shù)據(jù)量。經(jīng)過分析，每個樣品平均得到9，826，526個SNP和237，509個小的(＜5bp) InDel。從總SNP的數(shù)目來看，野生/半野生材料比栽培材料具有更多的遺傳多樣性。為在基因組水平上檢測栽培辣椒和野生/半

17、野生辣椒的差異，我們用Clustal X構(gòu)建了一個Neighbor-joining無根系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示，栽培辣椒形成一個類群，野生種/半野生辣椒形成另一個類群。用貝葉斯聚類的方法(K=2-5)分析上述材料的群體結(jié)構(gòu)，栽培種能夠形成一個亞群，保持相對的一致，與野生種/半野生種分離開。當K=5時，栽培種之間的區(qū)分最為明顯，而且還發(fā)現(xiàn)很多栽培材料內(nèi)含有野生材料的血緣，這在CM334、ZJ14、ZJ19、11c1363、ZJ18和Z兒2中表

18、現(xiàn)得尤為明顯，表明近期有從野生材料(如Chiltepin)到栽培材料的基因滲入。
　　為進一步檢測馴化導(dǎo)致的栽培辣椒群體多態(tài)性的降低，我們使用滑動窗口策略來估計栽培種群體的θπ和θw值。在栽培材料群體中共鑒定到115個具有強烈選擇掃蕩信號的區(qū)域，區(qū)域序列總長度85.2 Mb，占基因組序列的2.6％，這些區(qū)域含有511個選擇的“候選基因”。，它們分布在不同染色體上;人工選擇區(qū)域長度從0.3 kb到61.9 kb不等，且多態(tài)性水平相對

19、較低，說明這些區(qū)域是受人工馴化影響的。對獲得的511個“候選基因”進行富集分析，結(jié)果表明受人工選擇的“候選基因”主要集中在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、壓力和/或防御響應(yīng)、蛋白-DNA復(fù)合物的組裝、生長和果實的發(fā)育，其中有34個包括AP2、ERF和bHLH家族在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子和10個含有NB-ARC域的抗病蛋白基因。上述“候選基因”可能解釋栽培辣椒和野生辣椒之間存在的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)的差異。
　　6.辣椒和番茄果實發(fā)育的比較
　　通過比較番茄和辣椒

20、果實成熟期（6個轉(zhuǎn)色期前的階段、轉(zhuǎn)色期和3個轉(zhuǎn)色后階段）的基因表達模式，結(jié)果表明，番茄有2，281個差異表達基因，但辣椒只有1，440個，這些基因都參與了番茄和辣椒的細胞壁重塑、激素信號傳導(dǎo)和新陳代謝、碳水化合物的代謝、蛋白質(zhì)降解和非生物壓力響應(yīng)等。番茄和辣椒果實在成熟期基因的表達差異在一定程度上可能反映了具有轉(zhuǎn)變期的果實（如番茄）和沒有轉(zhuǎn)變期的果實（如辣椒）之間的差異，從而造成后者具有較慢的變軟過程，以及對乙烯處理沒有響應(yīng)的后果。

21、r>　　7.辣椒素生物合成相關(guān)基因的進化
　　基于前人對辣椒辣味相關(guān)基因的研究，本研究鑒定了參與辣椒素生物合成的51個基因家族，同時還鑒定了這些基因在番茄、馬鈴薯和擬南芥等3個物種中的直系同源基因。系統(tǒng)進化分析表明，和番茄、馬鈴薯和擬南芥相比較，辣椒發(fā)生了12個基因家族的獨立復(fù)制（如ACLd,AT3，β-CT,C3H,CAD，CCR，KasⅠ和PAL基因家族）?；蚩截愔g的序列分歧可能導(dǎo)致不同的功能或新功能化，促進了特異的辣椒素

22、生物合成的進化。以?；D(zhuǎn)移酶3(AT3)為例，本研究鑒定了at3基因(Pun1)3個串聯(lián)拷貝(AT3-D1，AT3-D2和AT3-D3)，at3基因編碼?；D(zhuǎn)移酶，并擔當一些辣椒品種辣味的調(diào)控子角色。和番茄和馬鈴薯AT同源基因比較，相鄰的?；D(zhuǎn)移酶基因AT3-D1和AT3-D2在保守的DFGWGKP motif發(fā)生一個氨基酸的突變(K390R)，這種突變可能導(dǎo)致AT3-D1和AT3-D2基因發(fā)生了功能的變化，能夠合成辣椒素并產(chǎn)生辣椒果實

23、獨特的辣味。
　　通過對不同辣度的辣椒果實相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比較分析，結(jié)果表明，隨著辣椒素含量的逐漸增加，除ACL-D4和ACL-D5基因外，其他參與辣椒素合成途徑的基因呈現(xiàn)組織/發(fā)育階段特異性表達，但是僅有CCoAOMT-D9，AT3-D1和AT3-D2等3個基因在辣椒果實發(fā)育階段顯著表達，而處于發(fā)育期的果實正是辣椒素合成的組織?；谏钊氲男蛄斜容^，發(fā)現(xiàn)在沒有辣味或者辣度極低的辣椒中AT3-D1基因有長度不等的片段缺失，可能使該

24、基因失去調(diào)控功能，但AT3-D2基因卻正常表達，并且在這些辣椒果實中仍然存在痕量的辣椒素（人類可能感知不到這種極低的辣味），這可能是由AT3-D2基因負責合成的。在辣度不同的辣椒中，AT3-D1和AT3-D2在CDS區(qū)都存在SNP，我們推測這兩個基因可能協(xié)同作用，合成并積累含量不同的辣椒素，這可能是一種與辣椒素積累相連的關(guān)鍵因素（或調(diào)控機制），可以決定不同品種辣椒的辣度。
　　辣椒基因組圖譜的完成將促進辣椒抗性、品質(zhì)等重要農(nóng)藝性狀