體外沖擊波對(duì)股骨頭缺血性壞死患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨及Cbfα1mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、目的：股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of thefemoral head，ANFH)一直是骨科界的難題之一，已有研究證實(shí)，ANFH患者全身性骨髓活性下降，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化增多，相應(yīng)地導(dǎo)致向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化減少，以致成骨細(xì)胞數(shù)量減少和骨髓成骨能力下降。目前，臨床對(duì)于Ficat Ⅰ-Ⅲ期ANFH患者尚無特別有效的治療方法。體外沖擊波療法(extra

2、corporeal shock wave therapy，ESWT)是一種用于治療骨肌系統(tǒng)疾病的新興無創(chuàng)的治療手段，近年來國內(nèi)外報(bào)道將ESWT用于治療早中期ANFH，取得了較為滿意的療效。核心結(jié)合因子alpha1(core binding factor alpha1，Cbfα1)不僅是成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，而且對(duì)軟骨細(xì)胞成熟、破骨細(xì)胞發(fā)育分化以及新生血管生成入侵軟骨組織的過程也起重要調(diào)節(jié)作用。體外沖擊波(extracorporeals

3、hock wave，ESW)干預(yù)ANFH患者M(jìn)SCs后Cbfα1mRNA如何表達(dá)，目前國內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)圍繞這一中心展開研究，以期從分子生物學(xué)水平解釋ESWI治療ANFH的有效性。 方法：本研究采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁法體外分離培養(yǎng)ANFH患者M(jìn)SCs；根據(jù)隨機(jī)原則將ANFH患者M(jìn)SCs分為A組(ESW干預(yù)組)、B組(空白對(duì)照組)； 經(jīng)最適能流密度(5kv/500頻次)干預(yù)后，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Co

4、unting Kit-8，CCK-8)法檢測(cè)A、B兩組不同時(shí)間點(diǎn)的光吸收(optical density，OD)值，比較細(xì)胞的增殖差異：應(yīng)用改良Gomori鈣鈷法和茜素紅染色分別檢測(cè)細(xì)胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和胞外基質(zhì)礦化程度，觀察比較A、B兩組細(xì)胞成骨分化差異；采用RT-PCR法結(jié)合光密度相對(duì)值半定量分析不同時(shí)間點(diǎn)Cbfα1mRNA和OCmRNA兩組表達(dá)量的差異。對(duì)上述各部分?jǐn)?shù)據(jù)采用相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)

5、方法進(jìn)行分析。 結(jié)果： 1.原代細(xì)胞光鏡下呈圓形，大小不一，數(shù)目較多，胞體折光性強(qiáng)，核呈橢圓形；24小時(shí)后即可觀察到部分細(xì)胞貼壁，48小時(shí)后貼壁細(xì)胞增多，有集落出現(xiàn)：5-7天后貼壁細(xì)胞呈克隆性集落生長，細(xì)胞形態(tài)部分轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形；大約兩周原代培養(yǎng)的細(xì)胞相互融合達(dá)到生長表面的85％時(shí)即可傳代； 2.傳代細(xì)胞A組早期呈集落樣生長；4-5天即可進(jìn)入增殖高峰期，核分裂相多，呈規(guī)則的方向性排列，絕大多數(shù)呈長梭形，后期細(xì)胞多呈

6、對(duì)稱分裂，呈旋渦樣網(wǎng)狀生長，由梭形變?yōu)閷挻笃教沟膸罨蚨噙厾?，表現(xiàn)出成骨分化趨勢(shì)；B組進(jìn)入增殖高峰期較晚，排列方向性差，且隨著時(shí)間延長，細(xì)胞出現(xiàn)不對(duì)稱分裂和多種分裂方式，兩個(gè)子細(xì)胞形態(tài)、大小不一，細(xì)胞器出現(xiàn)非等量分割，存在向其他類型細(xì)胞多向分化的表現(xiàn)； 3.細(xì)胞生死檢測(cè)試劑盒染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，A組經(jīng)ESW(5KV/500頻次)干預(yù)后，細(xì)胞活性與B組相比差異無顯著性差異。生長曲線顯示：A組從第2天開始OD值逐漸增加，6天后達(dá)到峰值，隨

7、后進(jìn)入平臺(tái)期；B組第3天開始OD值明顯增加，第7天達(dá)到峰值，隨后進(jìn)入平臺(tái)期。A、B兩組比較顯示，第1天時(shí)間點(diǎn)無明顯差異(P>0.05)，其余各時(shí)間點(diǎn)均有顯著性差異(P<0.05)： 4.改良鈣鈷法檢測(cè)顯示，A、B兩組細(xì)胞經(jīng)不同方法處理后6天均可發(fā)現(xiàn)ALP染色陽性，陽性率無明顯差異(P>0.05)；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，兩組ALP染色強(qiáng)度均明顯增強(qiáng)，A組更為明顯，胞內(nèi)外均有大量致密的黑色沉淀，染色強(qiáng)度明顯強(qiáng)于B組；B組雖有部分呈陽性，但強(qiáng)度

8、較弱，只有在胞漿可以看到散在分布的灰棕色沉淀，沒有大片的黑色沉淀，且細(xì)胞大小不一、形態(tài)多樣、胞界清晰。細(xì)胞ALP染色陽性率顯示，曲線均呈S型，A、B兩組各時(shí)間點(diǎn)(除6天時(shí)間點(diǎn))組間均有顯著性差異(P<0.05)，在24天時(shí)間點(diǎn)A組平均陽性率為90％，B組直至36天平均陽性率才上升至50％左右： 5.茜素紅法鈣化結(jié)節(jié)染色顯示：A組P7細(xì)胞培養(yǎng)20天，細(xì)胞長滿瓶底，呈多邊形成骨細(xì)胞狀，局部復(fù)層叢集生長，肉眼可見白色結(jié)節(jié)狀區(qū)域，茜索紅

9、染色可見大量橘紅色的鈣化結(jié)節(jié)；B組P7細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，肉眼未見白色結(jié)節(jié)狀區(qū)域，茜素紅染色可見少量分散的結(jié)節(jié)狀物質(zhì)，100倍鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果A組礦化結(jié)節(jié)數(shù)為7.0±1.3，B組無明顯結(jié)節(jié)，染色始終為陰性； 6.PCR 產(chǎn)物顯示，A、B兩組分別干預(yù)后第3天均檢測(cè)到Cbfα1mRNA表達(dá)，A組明顯強(qiáng)于B組；干預(yù)后第12天，A組檢測(cè)到骨鈣蛋白(osteocalcin,OC)mRNA的表達(dá)，B組第18天才有微弱表達(dá)，后期表達(dá)均逐

10、漸增強(qiáng)。光密度半定量分析顯示，Cbfα1mRNA在ESW誘導(dǎo)成骨分化的整個(gè)過程中持續(xù)表達(dá)，并在第12天時(shí)間點(diǎn)達(dá)到峰值，15天時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量有所減弱，除第3天時(shí)A、B兩組無顯著性差異(P>0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)A、B兩組相比均有顯著性差異(P<0.01)；OCmRNA的表達(dá)A組先于B組且光密度明顯強(qiáng)于B組，兩組比較12、18、24天時(shí)間點(diǎn)均有顯著性差異(P<0.01)。 結(jié)論： 1.適當(dāng)強(qiáng)度的ESW可促進(jìn)ANFH患者M(jìn)SCs

11、增殖，并誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化： 2.ESW作用ANFH患者M(jìn)SCs后ALP分泌增加及細(xì)胞外基質(zhì)礦化，表明ESW可促使其向成骨細(xì)胞分化并趨向成熟； 3.Cbfα1mRNA的表達(dá)是ANFH患者M(jìn)SCs成骨分化的早期表達(dá)產(chǎn)物，其先于OC的出現(xiàn)，并在ANFH患者M(jìn)SCs成骨分化的全過程中持續(xù)表達(dá)；OCmRNA在ANFH患者M(jìn)SCs細(xì)胞礦化期表達(dá)，是基質(zhì)礦化的關(guān)鍵因素； 4.ESW促進(jìn)ANFH患者M(jìn)SCs增殖，誘導(dǎo)其成骨分