體外沖擊波對早期股骨頭壞死區(qū)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞破骨分化的影響及相關(guān)臨床研究.pdf

1、股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)是臨床上有著較高發(fā)病率且呈進(jìn)行性發(fā)展的疾病，并以因局部供血不足而引起的骨細(xì)胞的壞死為特征。股骨頭的骨組織中含有各種活性細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞以及破骨細(xì)胞等，發(fā)生壞死時(shí)成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)的骨生成與破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)的骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)被打破，OB的成骨活性減弱，而OC的骨吸收活性增強(qiáng)，從而形成惡性循環(huán)，導(dǎo)

2、致壞死區(qū)進(jìn)一步擴(kuò)大。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)是具有多向分化潛能的干細(xì)胞，能夠在一定的微環(huán)境中向成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化，但向何種細(xì)胞分化取決于其所處的特定微環(huán)境，MSC在核因子KB受體活化因子配基(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL)等的誘導(dǎo)下會(huì)向OC分化，從而使骨吸收增強(qiáng)，股骨頭壞死區(qū)存在RANKL等

3、細(xì)胞因子，移植入壞死區(qū)的MSC一部分將會(huì)向破骨細(xì)胞分化。
　　體外沖擊波(Extracorporeal Shock Wave，ESW)是由電子水壓裝置、電磁裝置等產(chǎn)生的一種機(jī)械波，它可在固體和液體物質(zhì)以及人體組織中發(fā)揮作用，能促進(jìn)骨折斷端、骨缺損區(qū)和骨壞死區(qū)骨細(xì)胞的增生，促進(jìn)MSC向成骨細(xì)胞分化，具有確切的促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用。但ESW對股骨頭壞死區(qū)MSC破骨分化的影響尚不明確，ESW對MSC移植治療早期股骨頭壞死是促進(jìn)或是抑制

4、臨床中尚無相關(guān)研究。
　　本實(shí)驗(yàn)用ESW干預(yù)股骨頭壞死區(qū)MSC向破骨分化的過程，探討ESW對壞死區(qū)MSC向破骨分化的影響，并結(jié)合臨床實(shí)驗(yàn)，為體外沖擊波聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療早期股骨頭壞死提供更有力的證據(jù)。
　　第一部分體外沖擊波對早期股骨頭壞死區(qū)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞破骨分化的影響
　　目的：
　　通過HE染色，鬼筆環(huán)肽染色和TRAP染色觀察ESW干預(yù)股骨頭壞死區(qū)MSC向破骨分化過程中細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量的變化、RT-

5、PCR觀察破骨分化過程中特異基因表達(dá)的差異、掃描電子顯微鏡(scanning electronmicroscope，SEM)以及Coming Osteo骨細(xì)胞培養(yǎng)表面定量分析骨吸收能力，探討ESW對股骨頭壞死區(qū)MSC向OC分化的影響
　　方法：
　　1 MSC的獲取及分組：在武警總醫(yī)院行MSC移植治療股骨頭壞死的患者中，選取10名年齡18-30歲患者，在獲得患者知情同意的情況下，行股骨頭鉆孔時(shí)，收集股骨頭壞死區(qū)血約15mL，

6、實(shí)驗(yàn)室分離提純MSC，加入RANKL、M-CSF等細(xì)胞因子誘導(dǎo)為OC，ESW干預(yù)MSC向OC誘導(dǎo)為實(shí)驗(yàn)組，無ESW干預(yù)為對照組。
　　2 ESW干預(yù)對RANKL誘導(dǎo)MSC向QC分化過程的影響：在誘導(dǎo)OC的第1、3、5、7、9天分別給予2000頻次0.25 mJ/mm2的ESW干預(yù)，在光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目變化，HE染色，TRAP染色、鬼筆環(huán)肽熒光染色后，通過對多核細(xì)胞計(jì)數(shù)以及多核化率的計(jì)算，分析ESW對MSC向OC分化的影響；R

7、T-PCR檢測OC特異性基因表達(dá)水平的變化；SEM掃描骨吸收陷窩，并對陷窩面積及相對深度進(jìn)行分析；Corning Osteo骨細(xì)胞培養(yǎng)表面定量分析其骨吸收能力。ESW干預(yù)為實(shí)驗(yàn)組，無ESW干預(yù)的為對照組，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，設(shè)定p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1 MSC在50ng/ml RANKL以及25ng/ml M-CSF誘導(dǎo)下，從第7天開始，出現(xiàn)TRAP染色陽性(TRAP+)的多核破骨

8、細(xì)胞，第14天出現(xiàn)大量OC，通過HE染色以及鬼筆環(huán)肽和Hoechst-33258熒光染色以及TRAP染色對3核以上的OC進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算多核化率，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組多核OC數(shù)以及多核化率與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ESW干預(yù)后，MSC向OC分化減少；RT-PCR技術(shù)檢測OC特異性表達(dá)的基因TRAP和Cat K水平的變化，ESW組較對照組表達(dá)水平降低。
　　2將MSC接種在骨磨片上，加入誘導(dǎo)液第14天，用SEM掃描骨磨片

9、吸收陷窩，Image J軟件分析骨吸收陷窩的面積和相對深度，實(shí)驗(yàn)組分別為：12266.7±573.06μ m2，123.2±6.12，對照組為19557.9±711.39μm2，155.4±5.93，兩組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；MSC接種于Corning Osteo骨細(xì)胞培養(yǎng)表面，誘導(dǎo)培養(yǎng)第14天，光鏡下觀察吸收情況，并用Image J軟件分析吸收面積，實(shí)驗(yàn)組為9124.5±915.85μ m2，對照組為15800.7±

10、713.12μm2，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，ESW干預(yù)MSC誘導(dǎo)成的OC骨吸收能力降低。
　　結(jié)論：
　　1 ESW能夠抑制MSC向OC的分化過程，使分化的多核OC的細(xì)胞形成數(shù)量明顯減少，并使OC特異性基因表達(dá)水平降低；
　　2 ESW可有效抑制MSC分化成的OC的骨吸收能力，使骨吸收活性降低。
　　第二部分體外沖擊波對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療早期股骨頭壞死的影響的臨床研究
　　目的：將ESW

11、作用于MSC移植治療早期ONFH患者，通過治療前后Harris評分、MRI壞死面積的變化來評估治療效果，探討ESW對MSC移植治療早期股骨頭壞死的影響。
　　方法：
　　1實(shí)驗(yàn)對象的選取和干預(yù)措施：根據(jù)一定的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，選取2010-03至2011-03在武警總醫(yī)院收治的早期股骨頭壞死患者(ARCO分期Ⅰ期和Ⅱ期)36例，男21例，女15例，年齡18～45歲，平均32歲，全部為單側(cè)。其中24例按照隨機(jī)數(shù)字表法事先隨機(jī)分為

12、2組，分別為MSC移植組和ESW+MSC組，每組12例，患者就診時(shí)按著相應(yīng)的隨機(jī)分組序號進(jìn)入各組?？瞻讓φ战M12例，為門診就診的ONFH患者，拒絕臨床治療，但接受隨訪的患者。ESW組采用能流密度0.25-0.30 mJ/mm2，沖擊頻率60-100次/min，沖擊次數(shù)2000次的ESW治療，隔日一次，治療5次為一療程，患者共治療2-3療程，每一療程之間間隔3個(gè)月；MSC移植組在手術(shù)室接受移植手術(shù)治療；ESW+MSC組是MSC移植術(shù)后行E

13、SW治療，隨訪時(shí)間均為治療后1年。
　　2 ONFH干預(yù)后治療效果的評價(jià)：各組干預(yù)后1年對髖關(guān)節(jié)進(jìn)行Harris評分，并與干預(yù)前的Harris評分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；利用Image J軟件對干預(yù)前后同一層面髖關(guān)節(jié)MRI冠狀位上股骨頭壞死面積分析，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行配對t檢驗(yàn)和方差分析。
　　結(jié)果：
　　1在隨訪1年后，MSC移植組、ESW+MSC組以及對照組髖關(guān)節(jié)Harris評分分別為：86±3.49，94.67±3.63，47

14、.33±4.33，治療前分別為：56.58±4.94，55.58±4，54，59.08±2.99，各組治療前后差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療后MSC組和ESW+MSC組均較對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且ESW+MSC組較MSC組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　2隨訪1年后，MRI冠狀位同一層面上壞死面積由治療前的1987.01±88.55μ m2，1976.13±98.99μ m2，1991.37±97.43μ m2，治療1年后改變

15、為：269.63±58.50μ m2，46.02±21.07μm2，2256.95±143.34μm2。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組治療前后差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療后MSC組和ESW+MSC組均較對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且ESW+MSC組較MSC組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1 MSC移植以及ESW干預(yù)MSC移植治療ONFH均有一定的治療效果，且ESW干預(yù)MSC移植治療早期ONFH能夠獲得更好的治療效果。