自固化磷酸鈣人工骨松質(zhì)骨顆粒作骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞載體修復(fù)家兔股骨頭缺血性壞死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增技術(shù)在實(shí)驗(yàn)階段已經(jīng)成熟并且在臨床部分已經(jīng)開始應(yīng)用，但是尚未能找到其合適的載體，不便于臨床的實(shí)際應(yīng)用。為提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床應(yīng)用的療效，實(shí)驗(yàn)擬比自固化磷酸鈣人工骨松質(zhì)骨顆粒和自體松質(zhì)骨作為載體對(duì)實(shí)驗(yàn)性家兔股骨頭缺血性壞死的修復(fù)作用。
　　 方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提前一周飼養(yǎng)以適應(yīng)環(huán)境及觀察確定無(wú)疾病。術(shù)前一天禁食水。24只成年新西蘭大耳白兔，隨

2、機(jī)分為A、B兩組，每組12只，A組為白固化磷酸鈣人工骨（Calcium Phosphate Cement，CPC）松質(zhì)骨顆粒（CCPC）聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）移植組，B組為自體松質(zhì)骨聯(lián)合BMSCs移植組。兩組于術(shù)后2，4，6，8周各處死3只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
　　 2.BMSCs獲取培養(yǎng)及復(fù)合載體：術(shù)前1周從成年新西蘭大耳白兔髂后上嵴處抽取骨髓，種植于6孔

3、細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)液為含20％胎牛血清DMEM液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，傳代密度為1×106/cm2。第3代細(xì)胞培養(yǎng)至傳代密度時(shí)制成細(xì)胞懸液，A組分別浸潤(rùn)每個(gè)4mm×4mm×4mm大小CCPC，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24小時(shí)后手術(shù)植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物股骨頭鉆孔處；B組則分別浸潤(rùn)分成和CCPC一樣大小的明膠海綿顆粒，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)后，手術(shù)將松質(zhì)骨顆粒和載有BMSCs的明膠海綿均勻混合并植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物股骨頭鉆孔處。
　　 3.實(shí)

4、驗(yàn)動(dòng)物模型制備及手術(shù)方法：所有動(dòng)物雙側(cè)股骨頭都參加實(shí)驗(yàn)。取俯臥位，40mg/kg硫噴妥鈉腹腔注射麻醉。常規(guī)消毒，鋪單。髖關(guān)節(jié)后側(cè)切口，顯露股骨頭，不切斷圓韌帶，髖關(guān)節(jié)不脫位，保護(hù)周圍組織，用液氮棉團(tuán)連續(xù)冷凍股骨頭3分鐘造成股骨頭壞死模型。自然復(fù)溫后從股骨頸內(nèi)后側(cè)向股骨頭內(nèi)鉆孔，用直徑3.5mm鉆頭向股骨頭內(nèi)鉆入4mm，到達(dá)關(guān)節(jié)軟骨下。A組鉆孔后植入復(fù)合BMSCs的CCPC，關(guān)閉傷口。B組鉆孔后植入復(fù)合BMSCs的明膠海綿混合自體松質(zhì)骨顆

5、粒，關(guān)閉傷口。
　　 4.HE染色：取出10％福爾馬林中保存的股骨頭標(biāo)本，從股骨頸基底鋸斷，將標(biāo)本做標(biāo)記后放入8％甲酸溶液中換液三次，共脫鈣兩周。脫水、透明、浸蠟、修塊，做5μm切片，水浴，鋪片，烤片。然后行HE染色：熔蠟，酒精梯度水化，亞甲蘭染色，酸化，返蘭，伊紅染色，再酒精梯度脫水，透明。然后光學(xué)樹脂封片。
　　 5.X線及組織學(xué)觀察：X射線觀察鉆孔區(qū)骨密度及骨小梁的變化情況。蘇木精-伊紅染色切片，光鏡觀察鉆孔區(qū)細(xì)胞

6、及骨小梁的變化情況。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，對(duì)缺損區(qū)新生骨小梁圖像，進(jìn)行面積百分比均值的t檢驗(yàn)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.股骨頭X線檢查：A組2周標(biāo)本，鉆孔區(qū)可見股骨頭中部植入復(fù)合BMSCs的CCPC部位有明顯的高密度區(qū)，骨小梁結(jié)構(gòu)完整。4周標(biāo)本，鉆孔區(qū)高密度部分密度略減，鉆孔區(qū)以外密度有所增加，骨小梁結(jié)構(gòu)完整。6周標(biāo)本，內(nèi)植CCPC部分密度仍略高，出現(xiàn)骨小梁，鉆孔區(qū)界限模糊，鉆孔缺損區(qū)以外密

7、度有所增加，骨小梁紊亂，8周標(biāo)本，內(nèi)植CCPC部分密度基本正常，出現(xiàn)骨小梁，鉆孔區(qū)界限進(jìn)一步模糊。鉆孔缺損區(qū)以外密度有所增加，骨小梁紊亂，出現(xiàn)軟骨下囊性變。B組2周標(biāo)本鉆孔區(qū)密度減低，鉆孔區(qū)以外密度有所增加，骨小梁結(jié)構(gòu)完整。4周標(biāo)本，鉆孔區(qū)密度增高但仍低于正常，鉆孔區(qū)以外密度有所增加，骨小梁結(jié)構(gòu)完整。6周標(biāo)本，鉆孔區(qū)可見稀疏骨小梁，鉆孔區(qū)以外密度增加，骨小梁紊亂，出現(xiàn)軟骨下囊性變。8周標(biāo)本，鉆孔區(qū)密度基本正常，出現(xiàn)骨小梁，鉆孔區(qū)界限模糊

8、。鉆孔區(qū)以外密度有所增加，骨小梁紊亂，出現(xiàn)軟骨下囊性變。從總體上看，A組缺損區(qū)因植入完整的CCPC，故密度逐漸降低最后出現(xiàn)正常骨小梁結(jié)構(gòu)。B組缺損區(qū)植入明膠海綿混合自體松質(zhì)骨顆粒，密度由開始降低后升高，最后出現(xiàn)正常骨小梁結(jié)構(gòu)。
　　 2.股骨頭的組織檢查：A組術(shù)后2周時(shí)，鉆孔缺損區(qū)內(nèi)有大量的成骨細(xì)胞，缺損區(qū)邊緣有較多的類骨質(zhì)和新生骨小梁。4周時(shí)缺損區(qū)內(nèi)有大量骨小梁形成及類骨質(zhì)填充。6周時(shí)缺損區(qū)內(nèi)可見比較成熟的骨小梁，并出現(xiàn)骨髓組

9、織。在8周時(shí)缺損區(qū)內(nèi)骨小梁趨于成熟，并有大量骨髓組織形成。B組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的股骨頭標(biāo)本術(shù)后2周時(shí)，鉆孔邊緣形成較多新生骨組織，新生骨內(nèi)側(cè)有一個(gè)成骨細(xì)胞聚集層，而鉆孔區(qū)中心充滿了炎癥細(xì)胞。4周時(shí)，鉆空區(qū)新生骨小梁增多，但并不在全部區(qū)域，部分標(biāo)本在鉆孔中央形成少量骨組織，部分標(biāo)本無(wú)骨組織形成。6周時(shí)現(xiàn)象與4周的情況接近，只是骨小梁稍加成熟，有骨髓組織出現(xiàn)。鉆孔區(qū)有血管出現(xiàn)。8周時(shí)鉆孔邊緣區(qū)充滿分布不均勻的骨小梁組織和骨髓組織。
　　 統(tǒng)

10、計(jì)學(xué)分析：在術(shù)后8周時(shí)，兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物股骨頭鉆孔缺損區(qū)內(nèi)，骨小梁的面積百分比值分別為，A組為0.804650±0.0022681，B組為0.801267±0.0040373，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，具備方差齊性，總體無(wú)差別，兩兩比較P=0.842>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.BMSCs復(fù)合CCPC有很好的成骨作用，無(wú)細(xì)胞誘導(dǎo)因子亦可良好成骨；
　　 2.BMSCs復(fù)合CCPC修復(fù)股骨頭壞死效果等同