關(guān)節(jié)鏡監(jiān)視下hBMP-2基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞植入治療股骨頭缺血性壞死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、關(guān)節(jié)鏡監(jiān)視下hBMP-2基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療股骨頭缺血性壞死骨髓基質(zhì)系統(tǒng)中含有非造血組織的干細(xì)胞，因其能分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉、肌腱、骨髓基質(zhì)等多種間充質(zhì)組織的細(xì)胞而統(tǒng)稱為間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)或骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal stem cells，BMSCs)。對(duì)股骨頭缺血性壞死、骨組織工程學(xué)的研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不僅充當(dāng)骨生成細(xì)胞的來源，而且可

2、作為基因治療技術(shù)適宜的細(xì)胞載體。 股骨頭缺血性壞死的修復(fù)與重建是骨科常見的難題，臨床亟需能夠有效促進(jìn)股骨頭修復(fù)的新方法。對(duì)骨發(fā)生和修復(fù)的研究證實(shí)，成骨細(xì)胞的形成與成骨能力的增強(qiáng)是骨形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，BMP-2(Bone Morphogenetic Protein-2)是其中關(guān)鍵的骨形成因子，不僅可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的再生、遷移、聚集，并且介導(dǎo)成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、破軟骨細(xì)胞的分化及功能。因此，BMP一2促進(jìn)成骨能力可望成為骨科

3、疾病臨床治療的新途徑。然而，直接將BMP-2應(yīng)用于股骨頭壞死處易被周圍組織中的酶類所降解，作用時(shí)間短?；蛑委熌芸朔鲜鋈秉c(diǎn)，近年來應(yīng)用BMP-2基因治療骨缺損等各種骨科疾病成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，并已開始進(jìn)行臨床試驗(yàn)。本研究擬以兔MSCs為細(xì)胞模型，闡明體內(nèi)外培養(yǎng)兔MSCs的生長特性及其成骨潛能，構(gòu)建rAAV-2-hBMP-2轉(zhuǎn)染的兔MSCs復(fù)合物，探討其在修復(fù)兔股骨頭缺血性壞死中的作用，為股骨頭缺血性壞死的組織工程治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4、 目的：探討hBMP-2轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，及其在體外培養(yǎng)中的成骨能力。研究髓芯減壓關(guān)節(jié)鏡監(jiān)視下hBMP-2基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在治療股骨頭缺血性壞死中的作用及價(jià)值。 方法：在無菌條件、戊巴比妥鈉麻醉(30mg/Kg)下，雙側(cè)股骨外側(cè)髁和脛骨近端穿刺獲取成年新西蘭白兔(6月齡，體重2.5-3.0Kg)骨髓，采用密度梯度離心方法分離兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并大量擴(kuò)增，加入10 ml的1640(含10％的胎牛血清

5、)進(jìn)行培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長情況，鈣結(jié)節(jié)染色、堿性磷酸酶染色檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨能力。研究兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨潛能。制備rAAV-2-hBMP-2，以腺相關(guān)病毒介導(dǎo)hBMP-2轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，在細(xì)胞90％匯合后行病毒轉(zhuǎn)染過夜，感染被率(MOI)為100，每瓶約加1∶2稀釋的病毒液約4ml，換液后繼續(xù)培養(yǎng)。收獲轉(zhuǎn)染后24h至6d的轉(zhuǎn)染上清，應(yīng)用Westernblot檢測轉(zhuǎn)染MSCs中辛外源hBMP-2基因的

6、轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。36只新西蘭白兔建立液氮即刻冷凍股骨頭缺血性壞死模型，根據(jù)不同移植物隨機(jī)分為3組，每組12只，A組為空白骨壞死對(duì)照組，B組為髓芯減壓并MSCs組，C組髓芯減壓并hBMP-2轉(zhuǎn)染MSCs組。關(guān)節(jié)鏡監(jiān)視并對(duì)壞死骨清除后植入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，術(shù)后4周和8周對(duì)股骨頭行組織學(xué)檢查。 結(jié)果：原代培養(yǎng)中，第4天首次換液，成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞貼壁于培養(yǎng)瓶底，并有少數(shù)克隆形成，即來源于成纖維細(xì)胞克隆形成單位(Colony-forming

7、unit-fibroblasts,CFLJ-Fs)。第7-10天期間，克隆逐漸增多、增大，形成直徑5mm-8mm的較大克隆和(5mm的小克隆。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長鈣結(jié)節(jié)逐漸增多，細(xì)胞間出現(xiàn)致密圓形不透光團(tuán)塊，經(jīng)von Kossa染色呈現(xiàn)片狀的棕染，著色區(qū)域范圍廣、面積大；大部分堿性磷酸酶染色的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈陽性反應(yīng)。hBMP-2基因轉(zhuǎn)染的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可有效表達(dá)hBMP-2，其分泌于培養(yǎng)上清中的蛋白產(chǎn)物有促進(jìn)兔成骨細(xì)胞增值及增加成

8、骨細(xì)胞活性的作用。組織形態(tài)學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)植入后4周c組有明顯成骨，8周時(shí)壞死區(qū)被完全修復(fù)：B組只有較少新骨形成，8周時(shí)壞死區(qū)仍多為纖維組織。C組新骨體積明顯大于B組。造模后8周A組股骨頭塌陷：植入后8周B組股骨頭存在囊狀密度減低區(qū)：C組股骨頭形態(tài)規(guī)則，無塌陷。 結(jié)論：體外培養(yǎng)的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是具有成克隆性、自我更新能力的成纖維樣細(xì)胞；hBMP-2基因轉(zhuǎn)染的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可有效表達(dá)具有生物活性的hBMP-2蛋白，對(duì)以hBMP-