人骨髓間充質(zhì)干細胞與人股骨頭脫細胞骨基質(zhì)體外黏附及生長的早期觀察.pdf

1、目的:將正常的股骨頭與缺血性壞死的股骨頭經(jīng)脫細胞處理，處理后的脫細胞骨基質(zhì)與體外獲取的人骨髓間充質(zhì)干細胞(humanmesenchymal stem cells，hMSCs)混合培養(yǎng)，觀察并記錄hMSCs在兩種脫細胞骨基質(zhì)體外培養(yǎng)時早期的黏附、生長情況的差異，探討產(chǎn)生差異現(xiàn)象的原因，為MSCs移植治療股骨頭壞死的研究提供基礎(chǔ)理論及實驗依據(jù)。
　　方法:采集志愿提供無骨髓相關(guān)疾病患者的骨髓，采用全骨髓法培養(yǎng)、分離hMSCs，細胞鑒定

2、;取生長狀態(tài)良好的P1、P2、P3代細胞分別培養(yǎng)12天，繪制相應(yīng)代系hMSCs的生長曲線圖。收集股骨頭缺血壞死及股骨頸骨折患者的股骨頭，經(jīng)冠狀面中心截取骨片，經(jīng)脫細胞處理后制作成脫細胞骨基質(zhì)，分別命名為骨壞死組、非骨壞死組，對兩組脫細胞骨基質(zhì)進行HE染色及免疫組化處理，確定骨基質(zhì)無細胞成分及觀察骨基質(zhì)中纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、層粘連蛋白(laminin，LN)分布的情況。將兩組脫細胞骨基質(zhì)接種A(2×105/L)、B(

3、4×105/L)、C(6×105/L)3組不同濃度的第3代hMSCs，分別培養(yǎng)24小時、72小時及7天，記錄觀察每組的細胞黏附情況。計算相同濃度hMSCs下兩組培養(yǎng)24小時的黏附率，并應(yīng)用SPASS17.0軟件分析(P＜0.05)。對培養(yǎng)24小時組采用多聚甲醛(PFA)固定法固定共培養(yǎng)復合體熒光染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞黏附情況;對培養(yǎng)72小時及7天組取培養(yǎng)后的復合物HE染色后觀察細胞黏附分布情況，分別比較骨壞死與非骨壞死組、不

4、同濃度組細胞黏附情況的差別。
　　結(jié)果:全骨髓法培養(yǎng)分離可獲得純度較高hMSCs實驗用種子細胞，細胞呈均一的梭形、多角形、漩渦狀或輻射狀生長，其生長曲線呈符合細胞指數(shù)增殖的S形，細胞經(jīng)鑒定符合hMSCs表征。脫細胞骨基質(zhì)HE染色后觀察未見細胞成分，免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)骨基質(zhì)中的FN、LN在非壞死組脫細胞骨基質(zhì)中反應(yīng)連續(xù)，在壞死組則中斷。脫細胞骨基質(zhì)與hMSCs體外培養(yǎng)表現(xiàn)，12小時內(nèi)細胞完全貼附于瓶壁或黏附于脫細胞骨基質(zhì)上，培養(yǎng)液中無

5、懸浮未貼壁或黏附細胞。接種相同hMSCs濃度培養(yǎng)24小時細胞黏附率均數(shù)比較，骨壞死組與非骨壞死組分別為(44.40±3.22)％、(67.01±3.08)％。共培養(yǎng)24小時組激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)C組黏附細胞數(shù)量明顯高于A組，其中壞死組骨壞死區(qū)域黏附的細胞數(shù)量相對要少。共培養(yǎng)72小時及7天組表現(xiàn)為，非壞死組細胞黏附較均勻，而壞死組細胞黏附相對不均勻，靠近骨壞死區(qū)域細胞黏附較差，甚至個別骨塊骨壞死區(qū)域無細胞黏附現(xiàn)象，而遠離骨壞死區(qū)域細