DBO誘導K562細胞凋亡與自噬的作用研究.pdf

1、背景：慢性髓系細胞白血病(CML)是一種起源于多能干細胞的髓系惡性增殖性腫瘤，t(9;22)(q34; q11)是CML特征性染色體改變并在分子水平上導致BCR-ABL融合基因形成的。這種BCR-ABL融合基因形成的融合蛋白是一種能導致細胞轉化的多種信號蛋白相關的酪氨酸激酶。目前酪氨酸激酶抑制劑(TKI)（包括伊馬替尼，格列衛(wèi)等）已廣泛用于CML治療，使大部分CML忠者生存期延長，達到細胞遺傳學或分子生物學上的緩解。隨著TKI臨床應用時

2、間延長，TKI耐藥的問題也越來越明顯，積極探索新的藥物是一個亟待解決的問題。
　　DBO（6，8-dichoro-2，3-dihydro-3-hydroxymethyl-1，4-benzoxazine）是一種苯并惡嗪衍生物，有研究證實其可作為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制劑誘導人臍靜脈內皮細胞產生細胞活性氧物質(ROS)，從而誘導人臍靜脈內皮細胞發(fā)生自噬，促進其凋亡。然而，目前其抗腫瘤作用尚未廣泛研究，抗腫瘤作用的機制目前

3、尚無定論。關于DBO是否引起白血病細胞發(fā)生自噬、凋亡的研究尚未報道。本研究以人K562細胞為研究對象，分析DBO對K562細胞的增殖及其在誘導細胞凋亡和自噬方面的影響。
　　目的：本研究旨在探討DBO對人慢性髓系白血病K562細胞的增殖、自噬與凋亡的影響。
　　方法：常規(guī)方法復蘇、傳代培養(yǎng)K562細胞，設置對照組(DMSO)、DBO處理組。處理24、48和72h后收集細胞，采用蛋白質印跡法檢測LC3蛋白的表達。細胞免疫熒光實

4、驗檢測LC3斑點的表達;透射電鏡觀察細胞自噬現象。CCK-8比色法檢測K562細胞的活性和增殖能力。細胞周期實驗檢測K562細胞分裂能力。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡。
　　結果：蛋白質印跡結果顯示，K562細胞經雷帕霉素處理后LC3-Ⅱ蛋白表達水平升高，p62蛋白表達水平降低;經50μmol/L DBO處理24、48和72h后，LC3-Ⅱ和p62蛋白表達水平與雷帕霉素處理后結果相似，并呈時間依賴性。

5、K562細胞經10、25和50μmol/LDBO處理后，LC3-Ⅱ蛋白表達水平升高，p62蛋白表達水平降低，呈劑量依賴性，而使用自噬抑制劑3-MA后LC3-Ⅱ蛋白表達降低，P62蛋白表達升高。細胞免疫熒光實驗顯示，DBO作用72h后，與對照組相比，DBO處理組LC3斑點的表達量增加。透射電鏡觀察結果顯示，與對照組相比，DBO處理組細胞胞質內可見較多自噬小體和自噬溶酶體，細胞核不規(guī)則，染色質邊緣化。CCK8檢測結果顯示，DBO對K562細

6、胞的增殖具有明顯的抑制作用，并呈現時間-劑量依賴性。DBO經不同濃度(10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L)處理24 h的細胞增殖抑制率分別為（0.68±0.05）％、（2.76±0.35）％、（12.64±3.90）％、（22.58±2.41）％，F=67.389，P＜0.001，處理組與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義;48h的增殖抑制率分別為（3.83±1.06）％、（6.23±1.27）％、（15.

7、90±1.10）％、（24.50±2.51）％， F=145.738，P＜0.001，處理組與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義;72h的增殖抑制率分別為(8.78±1.28)％、（21.38±1.47）％、（32.11±2.01）％、(34.27±2.59)％，F=225.820，P＜0.001，處理組與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義。流式細胞術分析顯示K562細胞經DBO處理72h后，與對照組相比，G2/M期細胞比例增加，x2=276.706，