人參皂甙對(duì)K562細(xì)胞作用的基因表達(dá)譜研究.pdf

1、白血病是嚴(yán)重危害人類生命健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，迄今白血病的治療仍主要采用傳統(tǒng)的大劑量聯(lián)合化療，但此療法副作用大，復(fù)發(fā)率高，而且對(duì)正常機(jī)體免疫與造血系統(tǒng)有極大的損害。研究惡性腫瘤尤其是白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及逆轉(zhuǎn)機(jī)制已成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)最熱點(diǎn)的前沿課題之一。值得注意的是中藥以其調(diào)節(jié)陰陽(yáng)平衡、注重整體、攻補(bǔ)兼施、毒副作用小、應(yīng)用范圍廣泛的優(yōu)勢(shì)性得到了廣泛認(rèn)可和重視。從祖國(guó)醫(yī)學(xué)寶庫(kù)中尋找出既能促進(jìn)正常造血，又能抑制白血病細(xì)胞惡性增殖，并誘

2、導(dǎo)其向成熟方向分化的天然誘導(dǎo)分化劑已成為治療白血病的希望和重要途徑。 人參(Panax Ginseng)作為祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的“補(bǔ)氣”要藥，已有數(shù)千年的臨床應(yīng)用歷史，傳統(tǒng)的中醫(yī)學(xué)認(rèn)為人參具有大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾益肺、生津止渴、安神益智、補(bǔ)氣生血的作用。人參皂甙(Total saponins panax ginseng，TSPG)是人參的主要有效成分之一。近代研究證明，人參皂甙對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)都有影響，可以抑制細(xì)胞凋亡，抗感

3、染、擴(kuò)血管、抗衰老、并對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞的恢復(fù)有一定作用。研究還發(fā)現(xiàn)，該類化合物在癌癥的預(yù)防和治療方面具有較強(qiáng)的活性。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)人參的抗腫瘤作用及機(jī)制較為廣泛：可影響和調(diào)節(jié)免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)疾病的抵抗能力，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)；可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤的生長(zhǎng)或誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化使其逆轉(zhuǎn)；可抑制腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移及腫瘤細(xì)胞新生血管的形成；還可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性、增強(qiáng)抗癌藥的藥效。人參皂甙在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面表現(xiàn)為：在人肝癌SK-HEP-

4、1細(xì)胞中，人參皂甙作用于凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2非敏感途徑，活化caspase-3蛋白激酶，該酶促使細(xì)胞周期相關(guān)復(fù)合蛋白p21(WAF1/CIP1)裂解并伴有周期素A依賴蛋白激酶CDK2的活化，從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。在誘導(dǎo)分化方面表現(xiàn)人參皂甙粗提物可以使體外培養(yǎng)的Morris肝癌細(xì)胞在形態(tài)和功能方面向正常肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在抑制腫瘤新生血管形成等方面表現(xiàn)為：人參皂甙有抑制B16-BL6黑色素瘤細(xì)胞浸潤(rùn)基底膜，抑制腫瘤細(xì)胞與纖維粘蛋白和層粘蛋白的

5、黏附及入侵作用，并且能抑制腫瘤周圍新生血管的形成。但人參皂甙抗腫瘤作用的具體機(jī)制尚未完全闡明。 因此，本研究從分子水平上，利用基因表達(dá)譜芯片研究人參皂甙對(duì)體外培養(yǎng)的人紅白血病K562細(xì)胞作用后基因表達(dá)的改變，通過(guò)對(duì)芯片探針熒光信號(hào)值的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，找出人參皂甙作用前后細(xì)胞的差異表達(dá)基因，然后結(jié)合生物學(xué)軟件研究差異表達(dá)基因的不同類別和生物學(xué)通路中的具體作用，從而在基因水平上對(duì)人參皂甙抗腫瘤的具體作用機(jī)制進(jìn)行研究，為后續(xù)的藥物臨床研

6、究與開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)研究分兩部分： 第一部分：采用光鏡、流式細(xì)胞儀、細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白聯(lián)苯胺染色、透射電鏡等方法，觀察人參皂甙作用后K562細(xì)胞的各種變化。將K562細(xì)胞分為兩組，對(duì)照組為常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，處理組在常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞中加入不同濃度的人參皂甙。采用MTT法檢測(cè)人參皂甙對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制作用，運(yùn)用血紅蛋白聯(lián)苯胺染色的方法檢測(cè)人參皂甙對(duì)K562細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)兩組細(xì)胞的表面抗原CD15

7、與CD235ab的表達(dá)變化；并先后采用光鏡與透射電鏡觀察兩組細(xì)胞。 MTT比色法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)K562細(xì)胞增殖抑制程度有隨著人參皂甙濃度的增加而增強(qiáng)的趨勢(shì)；細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白聯(lián)苯胺染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)200μg/ml人參皂甙作用3天時(shí)細(xì)胞的血紅蛋白含量最高；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，200μg/ml的人參皂甙作用3天后，K562細(xì)胞表面分化抗原CD15與CD235ab表達(dá)量均升高，與對(duì)照組比較具有顯著性差異(P<0.01)，說(shuō)明200μg/ml的人

8、參皂甙具有誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系、粒系方向分化的作用。在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組與處理組細(xì)胞均呈圓形或卵圓形，散在或成簇排列。對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞直徑介于3-8μm之間；人參皂甙處理組細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少，細(xì)胞直徑介于2-6μm之間。透射電鏡結(jié)果顯示人參皂甙作用K562細(xì)胞后，核仁變小，且電子密度增大，核膜下異染色質(zhì)增多，胞漿中可見中等電子密度的膜被顆粒，其形態(tài)趨于成熟方向分化。 可見，人參皂甙能抑制K562細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其向紅

9、系、粒系細(xì)胞分化，提示人參皂甙有可能成為既能促進(jìn)正常造血，又能抑制白血病等腫瘤細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其分化的天然藥物。 第二部分：運(yùn)用基因芯片技術(shù)，檢測(cè)人參皂甙作用后K562細(xì)胞的基因表達(dá)譜變化。首先分別提取對(duì)照組和人參皂甙組K562細(xì)胞的總RNA，采用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA樣品的質(zhì)量鑒定。采用Agilent低RNA熒光線性擴(kuò)增試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行雙色熒光標(biāo)記：總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以Cy3標(biāo)記對(duì)照樣品，Cy5標(biāo)記人參皂甙處理

10、組樣品，合成熒光標(biāo)記的cRNA，并對(duì)標(biāo)記的cRNA進(jìn)行純化。純化后的樣品和Agilent Human 1A 60mer寡核苷酸基因芯片進(jìn)行雜交，雜交完畢后依次用漂洗緩沖液洗滌。然后采用Agilent基因芯片掃描儀掃描，掃描后的數(shù)據(jù)采用Feature Extraction軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及標(biāo)準(zhǔn)化處理。然后采用Panther數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行生物學(xué)功能分析。最后采用半定量RT-PCR對(duì)有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值且表達(dá)改變顯著的基因ODZ1、FO

11、SL1、CCNE2和LATS1進(jìn)行驗(yàn)證。 在芯片22153個(gè)檢測(cè)點(diǎn)中，發(fā)現(xiàn)共同差異表達(dá)基因362個(gè)，其中20個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，主要涉及細(xì)胞增殖與分化相關(guān)基因，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因，細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因等。表達(dá)下調(diào)的有342個(gè)，主要有免疫防御相關(guān)基因，蛋白質(zhì)合成、代謝與修飾相關(guān)基因，細(xì)胞周期相關(guān)基因等。RT-PCR結(jié)果表明，人參皂甙處理后，F(xiàn)OSL1、E2F2和CCNE2表達(dá)下調(diào)，ODZ1表達(dá)上調(diào)，與芯片雜交結(jié)果一致。 人參皂甙作用

12、后K562細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化為：促進(jìn)分化的基因上調(diào)，促進(jìn)增殖的基因下調(diào)，從而使K562細(xì)胞的增殖受到抑制并有利于K562細(xì)胞的分化。表明人參皂甙對(duì)K562細(xì)胞有一定的誘導(dǎo)分化和增殖抑制的作用。 綜上所述，本研究采用人參皂甙作用K562細(xì)胞，利用MTT法、光鏡、流式細(xì)胞儀、細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白聯(lián)苯胺染色、透射電鏡等手段，觀察了K562細(xì)胞的變化。研究表明，人參皂甙可以抑制K562細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)部分K562細(xì)胞的分化。研究進(jìn)一步結(jié)合