超長鏈多不飽和脂肪酸合成表達(dá)載體構(gòu)建及對(duì)棉花的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、多不飽和脂肪酸(PUFAs)對(duì)人體營養(yǎng)代謝及健康具有非常重要作用。隨著過度捕撈和海洋污染程度的增加，深海魚油的產(chǎn)量難于滿足市場需求。隨著PUFAs代謝途徑的基本揭示和相應(yīng)酶基因的陸續(xù)克隆，通過轉(zhuǎn)基因方法將EPA/DHA代謝途徑整合到高等植物（尤其是油料作物）中生產(chǎn)多不飽和脂肪酸已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)之一。我國是世界產(chǎn)棉大國，精煉棉籽油產(chǎn)量高，在食用油和食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛，而且棉籽油中的亞油酸含量明顯高于其他油料作物，可以為進(jìn)一步合成其他多不飽

2、和脂肪酸提供充足底物，因此棉花是進(jìn)行基因工程合成EPA/DPA的理想受體。
　　本試驗(yàn)采用多基因表達(dá)載體構(gòu)建的方法，將DGLA、EPA合成途徑中的各鏈延長酶及去飽和酶基因構(gòu)建到一個(gè)表達(dá)載體中，并導(dǎo)入擬南芥及魯棉研21號(hào)、魯棉研22號(hào)、農(nóng)大1018和邯無198等四個(gè)棉花品種（系）中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株;并對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行脂肪酸的測定分析，對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花植株進(jìn)行了目的基因拷貝數(shù)鑒定。獲得主要結(jié)果如下:
　　1.將多基因表達(dá)載體構(gòu)建

3、的輔助表達(dá)載體PAUX的35s啟動(dòng)子替換為大豆種子特異性啟動(dòng)子BCSP952，構(gòu)建了適合用于種子特異性基因研究的多基因輔助表達(dá)載體PAUX2。
　　2.以PAUX2輔助表達(dá)載體為基礎(chǔ)，按照“△8途徑”，構(gòu)建了能夠用于研究從LA、ALA到DGLA、ETA的表達(dá)載體pCamBAR-△8△9，能夠用于研究從LA、ALA到AA、EPA的表達(dá)載體pCamBAR-△5ω3△8△9。
　　3.通過遺傳轉(zhuǎn)化將這2個(gè)表達(dá)載體分別導(dǎo)入擬南芥，獲

4、得轉(zhuǎn)基因植株。在T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中檢測到0.1％的AA和0.225％的EPA、0.08％的DGLA及0.07％的ETA，而隱性對(duì)照中沒有這些脂肪酸的合成。這些結(jié)果表明，新構(gòu)建的2個(gè)表達(dá)載體能夠在擬南芥種子中表達(dá)并合成目標(biāo)產(chǎn)物。
　　4.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)噴花法及柱頭滴注法將表達(dá)載體pCamB AR-△8△9、pCamB AR-△5ω3△8△9分別對(duì)魯棉研21號(hào)、魯棉研22號(hào)、農(nóng)大1018和邯無198棉花品種進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化。經(jīng)過苗

5、期涂抹除草劑鑒定以及目的基因△5、ω3、△8、△9、BCSP952、Bar的PCR鑒定，篩選出31株轉(zhuǎn)化pCamBAR-△8△9陽性植株，篩選出27株轉(zhuǎn)化pCamBAR-△5ω3△8△9陽性植株。經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)△9Elo基因拷貝數(shù)鑒定表明，陽性植株中有13株包含2拷貝目的基因，11株包含3拷貝目的基因。
　　輔助表達(dá)載體PAUX2、多基因表達(dá)載體pCamBAR-△5ω3△8△9、pCamBAR-△8△9的構(gòu)建以及初步獲得的