骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)及血清濃度對其分化為神經元樣細胞的影響.pdf

1、目的：探討體外分離、純化大鼠骨髓間充質干細胞(bone marrowmesenchymal stem cells BMSCs)的方法及不同血清濃度對骨髓間充質干細胞體外誘導分化為神經元樣細胞的影響。動態(tài)觀察其形態(tài)學變化，并分析血清濃度對骨髓間充質干細胞誘導分化的影響，為骨髓間充質干細胞的移植提供實驗依據(jù)。
　　方法：1、選取清潔級4周齡SD大鼠，體重120g～200g。采用密度梯度離心法結合貼壁篩選法分離純化骨髓間充質干細胞，并傳

2、代擴增，進行形態(tài)學觀察，采用流式細胞儀檢測細胞表面抗原的表達。2、將擴增培養(yǎng)至第3代的骨髓間充質干細胞分為6組：第一組(無血清組)，2％B27預誘導72h后，10ng/mlbFGF+10ng/mlEGF正式誘導，其余各組分別加入1％FBS、2％FBS、5％FBS、10％FBS、20％FBS。在倒置顯微鏡下觀察誘導過程中細胞的形態(tài)分化，并采用RT-PCR及免疫熒光法對誘導后的細胞進行鑒定。
　　結果：1、運用密度梯度離心法結合貼壁培

3、養(yǎng)法能成功有效地分離純化大鼠BMSCs，并可穩(wěn)定傳代，表型鑒定結果為CD90、CD29陽性，CD34陰性。2、采用EGF、bFGF可成功誘導BMSCs向神經樣細胞分化，誘導過程中細胞形態(tài)學發(fā)生變化。誘導后BMSCs的胞體變圓，折光率增加，并伸出有2～3支或更多突起。RT-PCR示誘導后BMSCs表達巢蛋白(Nestin)、膠質原性纖維酸性蛋白(GFAP)；免疫熒光染色示誘導后神經細胞的標志物神經烯醇化酶(NSE)以及GFAP表達陽性。3

4、、BMSCs經誘導完成分化后，2％血清組NSE顯色最多，GFAP最少，而20％血清組NSE顯色最少，2％血清組細胞平均分化率為27.25％，20％血清組平均分化率為13.25％。體外誘導BMSCs向神經樣細胞分化時，2％血清濃度可起促進作用，而高濃度血清則起抑制作用。
　　結論：密度梯度離心法結合貼壁篩選法可以有效地體外分離純化、培養(yǎng)擴增BMSCs，并能穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。采用EGF/bFGF方案，能成功誘導骨髓間充質干細胞分化為神經樣