醫(yī)用臭氧對(duì)體外培養(yǎng)大鼠脊髓神經(jīng)元的毒性研究.pdf

1、目的：觀察不同濃度醫(yī)用臭氧對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠脊髓神經(jīng)元的損傷作用，并初步探討其損傷機(jī)制。 方法：從孕14天Wistar大鼠胚胎組織中獲取脊髓神經(jīng)元，體外培養(yǎng)至第6～7天，免疫熒光化學(xué)方法行細(xì)胞純度鑒定。將鑒定后的脊髓神經(jīng)元分成5組，分別為對(duì)照組、氧氣組、20μg/mL、40μ/mL和60μ/mL臭氧組。利用真空泵將膠塞密封好的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壓力降至-0.6kPa，除對(duì)照組外，其余各組注入濃度分別為20，40和60μg/mL的醫(yī)用臭氧及氧

2、氣各20mL。氣體干預(yù)20分鐘后，將培養(yǎng)瓶放回孵箱內(nèi)繼續(xù)孵育2.5小時(shí)。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，Hoechst33258熒光染料顯示細(xì)胞核損傷，提取全細(xì)胞蛋白行生化指標(biāo)及蛋白檢測(cè)。選用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定細(xì)胞SOD水平、硫代巴比妥酸法測(cè)定細(xì)胞MDA水平、簡(jiǎn)易測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞LDH漏出率。采用Western Blot檢測(cè)Bcl-2，Bax及MAP2的表達(dá)水平變化。 結(jié)果： （1）細(xì)胞培養(yǎng)及純度鑒定：細(xì)胞培養(yǎng)至第6～

3、7天，熒光顯微鏡下觀察MAP-2陽(yáng)性神經(jīng)元的純度為87.70±8.70％； （2）光鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：發(fā)皰細(xì)胞為最為常見(jiàn)也最具特色的形態(tài)學(xué)改變且隨臭氧濃度升高，神經(jīng)元突起扭曲斷裂，表現(xiàn)為串珠樣改變； （3）Hoechst33258示DNA形態(tài)學(xué)變化：對(duì)照組細(xì)胞為均勻一致的淡藍(lán)色；氧氣組神經(jīng)元細(xì)胞核DNA出現(xiàn)斷裂、邊集；臭氧干預(yù)組神經(jīng)元染色質(zhì)濃縮發(fā)亮且呈劑量相關(guān)； （4）生化指標(biāo)檢查：SOD，MDA及LDH的測(cè)定值均隨

4、著臭氧干預(yù)濃度升高而升高，MDA與LDH升高較早（40μg/mL），且曲線斜率較之SOD更大。 （5）Western Blot檢測(cè)凋亡蛋白：隨著臭氧干預(yù)濃度的升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平未見(jiàn)明顯趨勢(shì)，而凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平卻有穩(wěn)定的上升。神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白2的表達(dá)水平隨著臭氧干預(yù)濃度的升高而不斷下降。 結(jié)論：醫(yī)用臭氧對(duì)于體外培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元具有細(xì)胞毒作用，在較低干預(yù)濃度下（20μg/mL），脊髓神經(jīng)元表現(xiàn)出非常