宿主蛋白AGO2抑制IFN--β表達(dá)對(duì)A型流感病毒增殖的影響.pdf

1、A型流感病毒是一種重要的人獸共患傳染病，一直以來(lái)受到世界高度重視。其中，病毒與宿主間相互作用種類和形式多樣，是研究熱點(diǎn)。流感病毒感染宿主細(xì)胞激活的抗病毒天然免疫信號(hào)通路主要是RIG-Ⅰ信號(hào)通路;宿主蛋白AGO2是一種多功能蛋白質(zhì)，對(duì)其研究主要集中在腫瘤和發(fā)育生物學(xué)等方面，免疫方面有所研究，但研究尚少。本研究發(fā)現(xiàn)宿主蛋白AGO2能夠通過(guò)與CBP/p300競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IRF3影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，從而抑制IFN-β的產(chǎn)生;同時(shí)初步的研究發(fā)現(xiàn)

2、流感病毒可以通過(guò)利用宿主蛋白AGO2調(diào)節(jié)vRNA的分布促進(jìn)病毒增殖。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1AGO2真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)
　　以人的mRNA反轉(zhuǎn)獲得的cDNA為模板，成功擴(kuò)增AGO2基因并構(gòu)建出其真核表達(dá)質(zhì)粒。用構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞和A549細(xì)胞，Western Blotting結(jié)果顯示AGO2的真核表達(dá)質(zhì)粒能夠在細(xì)胞內(nèi)很好的表達(dá)，表達(dá)的AGO2大小與已知的一致。
　　用構(gòu)建的AGO2的

3、真核表達(dá)質(zhì)粒過(guò)表達(dá)和用siRNA干擾AGO2基因的方法改變AGO2在A549細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平，并用H5N1禽流感病毒感染該細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)AGO2使病毒在A549細(xì)胞上的增殖能力增強(qiáng);沉默AGO2使病毒在A549細(xì)胞上的增殖能力減弱。本研究發(fā)現(xiàn)了宿主蛋白AGO2能夠影響H5N1在A549細(xì)胞上的增殖。本研究同時(shí)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了蛋白AGO2對(duì)IFN-β的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在A549細(xì)胞中AGO2能夠影響IFN-β及其下游基因的表達(dá)。
　

4、　2蛋白AGO2抑制IFN-β表達(dá)的研究
　　本研究首先在高轉(zhuǎn)染效率的HEK293T細(xì)胞中進(jìn)一步檢測(cè)了AGO2對(duì)細(xì)胞中IFN-β表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明宿主蛋白AGO2能夠抑制IFN-β的表達(dá)。因此，本研究接下來(lái)深入探索研究了AGO2抑制IFN-β表達(dá)的具體機(jī)制。
　　流感病毒等RNA病毒激活的干擾素信號(hào)通路主要是RIG-I信號(hào)通路。本研究通過(guò)雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)了AGO2對(duì)RIG-Ⅰ通路上各接頭分子誘導(dǎo)干擾素的影響，結(jié)果表明

5、AGO2抑制IFN-β表達(dá)發(fā)生在IRF3或其下游。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)AGO2并不影響IRF3的磷酸化、入核，以及IRF3與DNA結(jié)合的能力等。因此蛋白AGO2抑制干擾素表達(dá)可能發(fā)生在IRF3的下游。
　　免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了AGO2能夠與IRF3相互作用。為此本研究構(gòu)建了IRF3的N端和C端兩個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域的真核表達(dá)質(zhì)粒，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AGO2能夠與IRF3的C端結(jié)構(gòu)區(qū)域發(fā)生相互作用。進(jìn)而可以推測(cè)，AGO2與IRF3的C端區(qū)域的相互作

6、用影響了IRF3與下游分子的相互作用。
　　本研究構(gòu)建了IRF3下游分子CBP/p300上能夠與IRF3相互作用的區(qū)域（即IBiD區(qū)）的真核表達(dá)質(zhì)粒。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AGO2能夠影響IRF3與IBiD的結(jié)合。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明AGO2影響IRF3與CBP發(fā)生相互作用，進(jìn)而影響干擾素的表達(dá)。
　　本研究構(gòu)建了宿主蛋白AGO2的四個(gè)功能區(qū)的真核表達(dá)質(zhì)粒，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AGO2的MID區(qū)域能夠與IRF3發(fā)生相互作用。為了進(jìn)一步

7、說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究構(gòu)建了AGO2的缺失MID區(qū)突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AGO2的MID缺失突變體不能夠與CBP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IRF3。
　　最終本研究發(fā)現(xiàn):蛋白AGO2能夠通過(guò)與CBP/p300競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IRF3而影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，從而影響IFN-β的表達(dá)。
　　3宿主蛋白AGO2與H5N1流感病毒之間的互做關(guān)系
　　本研究對(duì)宿主蛋白AGO2與H5N1流感病毒復(fù)制之間的關(guān)系進(jìn)行了探索。H5N

8、1感染A549細(xì)胞后檢測(cè)AGO2在細(xì)胞核內(nèi)分布情況表明，感染細(xì)胞6h后，與對(duì)照相比AGO2在細(xì)胞核內(nèi)的分布增多;H5N1感染A549細(xì)胞36h后，與對(duì)照相比AGO2在細(xì)胞核內(nèi)的分布減少。本研究同時(shí)檢測(cè)了AGO2對(duì)H5N1流感病毒vRNA在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和分布的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AGO2能夠促進(jìn)流感病毒vRNA的復(fù)制并能夠影響vRNA在細(xì)胞核內(nèi)外的分布。通過(guò)初步的研究可以推測(cè)，在H5N1感染早期AGO2使病毒vRNA分布在細(xì)胞核，從而有利于病毒復(fù)