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文檔簡介
1、背景:
人副流感病毒(humanparainfluenzaviruses,hPIVs)是屬于副粘病毒科的單負鏈RNA病毒,也是一類常見的社區(qū)獲得性呼吸道感染病原體。根據(jù)遺傳學和抗原性的不同,將hPIVs分為4個血清型及2個血清亞型(hPIV-1、2、3、4a、4b),其中人副流感病毒3型(humanparainfluenzavirustype3,hPIV3)感染率高,持續(xù)時間長,主要引發(fā)六月齡以下嬰幼兒下呼吸道感染所致的細支氣
2、管炎和肺炎,是僅次于呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus,RSV)的第二大病原體。迄今為止,hPIV3感染尚無有效的防治措施,各類疫苗也正處于研發(fā)攻堅階段,近年來取得了重要進展。然而,針對人體的安全有效的疫苗仍未問世,其主要障礙是對致病機制中病毒與靶細胞的融合機制尚未明確。
病毒包膜和靶細胞膜的融合是副粘病毒入侵和感染宿主細胞關(guān)鍵步驟。該過程是在附著蛋白的協(xié)助下,由同源性融合蛋白介導而發(fā)生的。根據(jù)
3、功能的不同,將副粘病毒附著蛋白分為HN、G、H三類,其中HN蛋白功能豐富,存在廣泛,受到研究者的普遍關(guān)注。HN蛋白以四聚體的形式存在于病毒包膜和宿主細胞膜上,主要功能有:①識別唾液酸受體并吸附于靶細胞膜表面;②發(fā)揮神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)活性,促進子代病毒擴散;③特異性觸發(fā)同源F蛋白并使其發(fā)生一系列構(gòu)象改變,最終啟動膜融合。HN蛋白由頭部區(qū)、莖部區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾區(qū)四部分組成,其中球狀頭部區(qū)主要負責結(jié)合受體和發(fā)揮N
4、A活性,已受到深入研究;而莖部區(qū)結(jié)構(gòu)及功能目前尚未明確,通常認為其對HN蛋白低聚化和特異性觸發(fā)同源性F蛋白具有重要作用。
近期研究發(fā)現(xiàn),大部分副粘病毒附著蛋白莖部區(qū)存在四螺旋束狀結(jié)構(gòu)(four-helixbundle,4HB),其疏水性核心由11個重復(fù)的氨基酸序列(i,i+3,i+4,i+4)組成,更新了此前定義的七肽重復(fù)序列(i,i+3,i+4)模型的概念。同時,通過對比不同副粘病毒附著蛋白的十一肽重復(fù)序列可以發(fā)現(xiàn),副粘病毒
5、莖部區(qū)疏水性氨基酸核心部分較為保守,對其進行突變可能影響HN蛋白正常的結(jié)構(gòu)和功能,為莖部關(guān)鍵氨基酸的定位提供了新的思路。迄今為止,尚未出現(xiàn)針對hPIV3HN莖部十一肽重復(fù)序列保守氨基酸的突變分析。
本研究將hPIV3HN作為研究對象,通過比對與其結(jié)構(gòu)高度相似的新城疫病毒(Newcastlediseasevirus,NDV)HN蛋白及副流感病毒5型/猴副流感病毒(parainfluenzavirustype5,PIV5)HN蛋白
6、莖部十一肽重復(fù)區(qū)的氨基酸序列,確定了該區(qū)域存在的5個保守氨基酸位點,并將其突變?yōu)楸彼?。通過檢測突變體蛋白各活性的改變,明確hPIV3HN莖部十一肽重復(fù)序列中起關(guān)鍵作用的氨基酸位點,分析其發(fā)生作用的原因,進一步加深對副粘病毒HN蛋白莖部區(qū)在融合機制中作用的理解。
目的:
1.確定hPIV3HN莖部十一肽重復(fù)序列保守氨基酸中起關(guān)鍵作用的位點。
2.分析并闡述關(guān)鍵氨基酸改變對HN蛋白結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生影響的原因。<
7、br> 3.進一步理解HN蛋白莖部區(qū)在融合機制中的作用。
方法:
1.突變體的構(gòu)建:比對hPIV3、NDV、PIV5中HN蛋白的DNA序列,確定hPIV3HN莖部區(qū)十一肽重復(fù)序列中5個保守氨基酸I102、P111、L114、S119、I125,結(jié)合同源重組和定點突變技術(shù),將其分別突變?yōu)楸彼帷?br> 2.突變體的表達:利用陽離子轉(zhuǎn)染試劑TurboFectTMTransfectionReagent使待轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒
8、進入傳代乳鼠腎細胞(babyhamsterkidneycell,BHK-21)細胞,并通過痘苗病毒-T7瞬時表達系統(tǒng)將其表達。
3.促細胞融合活性的分析:同時轉(zhuǎn)染突變體pBSK-HN及野生型pBSK-F質(zhì)粒到BHK-21細胞,觀察合胞體形成情況。利用Giemsa染色定性觀察并記錄各突變體蛋白合胞體形成情況,利用指示基因法定量測定各突變體蛋白的促細胞融合活性。
4.受體識別活性的分析:分別轉(zhuǎn)染突變體pBSK-HN質(zhì)粒到
9、BHK-21細胞,利用血細胞吸附(hemadsorption,HAD)實驗檢測各突變體蛋白的受體識別活性。先定性觀察并記錄光學顯微鏡下新鮮人紅細胞(redbloodcell,RBC)吸附情況,再將已吸附的RBC裂解通過比色定量測定各突變體蛋白的受體識別活性。
5.神經(jīng)氨酸酶活性的分析:同時轉(zhuǎn)染突變體pBSK-HN及野生型pBSK-F質(zhì)粒,觀察合胞體形成情況。消化并裂解細胞后高速離心,利用神經(jīng)氨酸酶檢測試劑盒,通過酶促反應(yīng)檢測上
10、清中神經(jīng)氨酸酶的含量,以此定量測定各突變體蛋白的神經(jīng)氨酸酶活性。
6.半融合活性的分析:同時轉(zhuǎn)染突變體pBSK-HN及野生型pBSK-F質(zhì)粒,觀察合胞體形成情況。利用羅丹明B(octadecylrhodamineB,R18)熒光探針標記新鮮RBC懸液,觀察半融合狀態(tài)下熒光探針由RBC表面轉(zhuǎn)移到靶細胞膜表面的現(xiàn)象,以研究突變體蛋白是否對膜融合的初始階段產(chǎn)生影響。
結(jié)果:
1.DNA測序結(jié)果表明,指定位點氨基酸
11、已分別突變?yōu)楸彼?,突變體質(zhì)粒I102A、P111A、L114A、S119A和I125A均構(gòu)建成功。
2.突變體蛋白I102A、P111A、L114A、S119A和I125A突變體蛋白的促細胞融合活性均發(fā)生不同程度下降,分別為野生型的6%、16%、14%、87%和4%;除S119A以外,其他突變體蛋白與野生型相比差別均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
3.突變體蛋白I102A、P111A、L114A、S119A和I1
12、25A的受體識別活性均發(fā)生不同程度下降,與野生型相比依次為32.2%、77.4%、74.2%、83.9%和38.7%,其中I102A及I125A的受體識別活性與野生型相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
4.突變體蛋白I102A、P111A、L114A、S119A、I125A的神經(jīng)氨酸酶活性分別為野生型的66.5%、73.1%、69.1%、76.1%和72.8%,與野生型相比差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
5
13、.突變體蛋白I102A、P111A、L114A、S119A、I125A的半融合活性均發(fā)生下降,僅突變體蛋白S119A半融合活性較高,突變體蛋白I102A、P111A、L114A、I125A的半融合活性大幅度下降或基本喪失。
結(jié)論:
1.hPIV3HN中莖部十一肽重復(fù)序列對其促細胞融合活性和受體識別合活性具有重要意義。
2.明確了I102、P111、L114、I125在hPIV3HN莖部十一肽重復(fù)序列保守氨基
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