自噬在低氧誘導(dǎo)的肺血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用及apelin調(diào)控機制.pdf

1、目的：
　　隨著對肺動脈高壓這種疾病研究的越來越深入，人們逐漸意識到抑制肺動脈平滑肌細(xì)胞的異常增殖及遷移，尋求更加有效的治療新靶點很有必要。細(xì)胞自噬是一個新興的研究領(lǐng)域，人類目前所知的內(nèi)容僅僅是自噬的冰山一角，而且很多研究都顯示:自噬參與人類的正常發(fā)育及疾病的進程，那么自噬是否也參與了肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展，對于發(fā)病晚期的平滑肌細(xì)胞異常增殖和遷移過程是否也發(fā)揮了作用？是保護性的還是損傷性？這些都還未被明確闡述。因此，在我的研究中引入

2、了細(xì)胞自噬。對于小分子活性肽apelin，我們實驗室的研究比較多，發(fā)現(xiàn)其具有降低肺動脈壓力和預(yù)防肺血管重建的作用，但是這些研究主要集中在動物水平上，本課題利用原代培養(yǎng)的肺動脈平滑肌細(xì)胞，探索apelin對低氧性PASMCs增殖和遷移的調(diào)控作用及與自噬的關(guān)系，為肺動脈高壓治療研究提供新的理論思路與實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscu

3、larcells，PASMCs)，并采用α-actin免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定。
　　2、采用BrdU免疫細(xì)胞化學(xué)法研究不同低氧時間對PASMCs增殖的影響。根據(jù)低氧處理時間不同，將實驗分為control組、低氧6h組、低氧12h組、低氧24h組和低氧48h組，共五組。其中control組使用的是二氧化碳（二相）培養(yǎng)箱，設(shè)定的環(huán)境為:37℃，5％CO2、21％O2;低氧各組使用的是二氧化碳（三相）培養(yǎng)箱，設(shè)定的環(huán)境為37℃、5％CO2、

4、1％O2。
　　3、分別采用Transwell小室侵襲實驗及流式細(xì)胞術(shù)研究不同低氧時間對PASMCs遷移和細(xì)胞周期的影響。實驗分為兩組:control組和低氧24h組。
　　4、分別采用MDC和LC3/DAPI免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western blot法檢測不同低氧時間對PASMCs胞漿內(nèi)自噬空泡堆積、自噬體生成和自噬相關(guān)蛋白LC3表達的影響。實驗分為四組:control組、低氧6h組、低氧12h組、低氧24h組。
　　

5、5、采用MDC和LC3/DAPI免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測自噬抑制劑3-MA對PASMCs胞漿中自噬空泡堆積和自噬體生成的影響。實驗分為:control組、低氧24h組、低氧24h+3-MA組和3-MA組。
　　6、分別采用BrdU免疫細(xì)胞化學(xué)法和Transwell小室侵襲實驗研究自噬抑制劑3-MA對PASMCs增殖和遷移的影響。實驗分組同上一步。
　　7、用免疫細(xì)胞化學(xué)法探索不同apelin濃度（0μmol/L、0.1μmol/L

6、、0.5μmol/L、1μmol/L）對低氧24h組及control組PASMCs增殖的影響，并選擇合適的apelin實驗濃度。
　　8、分別采用劃痕實驗、MDC和LC3/DAPI免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測apelin（1μmol/L）對細(xì)胞遷移及細(xì)胞胞漿中自噬空泡堆積和自噬體生成的影響。實驗分為control組、低氧24h組、低氧24h+apelin組、apelin組，共四組。
　　結(jié)果：
　　1、α-actin免疫細(xì)胞化學(xué)

7、染色結(jié)果顯示:原代培養(yǎng)的PASMCs細(xì)胞純度高達（97±3）％，可用于細(xì)胞實驗。
　　2、用BrdU免疫細(xì)胞化學(xué)法得出:與control組相比，低氧能夠促進PASMCs增殖，并且低氧24小時和48小時增殖水平更為明顯（P＜0.05）。
　　3、Transwell小室侵襲實驗結(jié)果顯示:與control組相比，低氧24小時的PASMCs遷移更明顯(P＜0.05）。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果:與control組相比，低氧24小時的PASM

8、Cs處于S期的細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P＜0.05）。
　　4、應(yīng)用熒光顯微鏡觀察MDC和LC3/DAPI免疫熒光染色結(jié)果表明，與control組相比，低氧處理的PASMCs胞漿中自噬空泡堆積明顯增多，自噬標(biāo)志性蛋白LC3熒光表達明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Western blot結(jié)果表明，與control組相比，低氧促使自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明顯增加（P＜0.05）。
　　5、應(yīng)用自噬抑制劑3-

9、MA明顯抑制低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。應(yīng)用熒光顯微鏡觀察MDC和LC3/DAPI免疫熒光染色結(jié)果表明，與低氧組相比，自噬抑制劑3-MA明顯抑制了低氧引起PASMCs中自噬空泡聚集，降低了自噬標(biāo)志性蛋白LC3熒光表達（P＜0.05）。
　　6、BrdU免疫細(xì)胞化學(xué)法和劃痕法的結(jié)果表明，與低氧組相比，3-MA明顯抑制了低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移（P＜0.05）。
　　7、BrdU免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)果顯示:apelin(1μmol/L)能夠

10、明顯抑制低氧24h組PASMCs的增殖(P＜0.05)。
　　8、應(yīng)用apelin(1μmol/L)作用于PASMCs，劃痕法的結(jié)果表明，apelin明顯抑制了低氧誘導(dǎo)的PASMCs遷移(P＜0.05)。應(yīng)用熒光顯微鏡觀察免疫熒光染色結(jié)果表明，與低氧組相比，apelin明顯抑制了低氧引起PASMCs胞漿中自噬空泡聚集，降低了自噬標(biāo)志性蛋白LC3熒光表達(P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、低氧不僅促進PASMCs的增