TGFβ1基因轉(zhuǎn)染大鼠樹突狀細胞增強移植心臟耐受性及相關趨化因子表達的研究.pdf

1、目的:1.建立從大鼠骨髓前體細胞分離、培養(yǎng)和擴增樹突狀細胞(dendritic cell,DC)的方法;研究影響骨髓DC(bone marrow derived DC,BM-DC)分化、成熟的相關因素以及不同分化時期DC的免疫免疫生物特性.2.構(gòu)建人TGFβ1基因的真核表達質(zhì)粒TGFβ1-pcDNA3以及反義TGFβ1-pcDNA3(ASTGFβ1-pcDNA3)并轉(zhuǎn)染大鼠DC,研究TGFβ1基因轉(zhuǎn)染對DC的成熟分化以及免疫功能的影響.

2、3.觀察TGFβ1-DC在受者大鼠體內(nèi)遷移歸巢途徑及微嵌合水平,檢測受者次級淋巴器官T細胞凋亡和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)表達的變化.4.探討TGFβ1-DC對移植心臟的急性排斥反應發(fā)生時間、排斥反應級別以及存活時間的影響;并進一步研究TGFβ1-DC輸注對移植受者體內(nèi)多種相關趨化因子及其受體表達的影響.方法:分離F344大鼠骨髓前體細胞,在rmGM-CSF

3、+TGFβ1或rmGM-CSF+rmIL-4的聯(lián)合作用下,培養(yǎng)、擴增大鼠骨髓來源DC(bone marrow derived DC,BM-DC).分別從形態(tài)學(光鏡、電鏡)、免疫細胞化學(FACS,ICC)以及免疫生物學(MLR)等方面研究大鼠BM-DC的免疫生物特性.構(gòu)建重組人TGFβ1-pcDNA3表達質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染DC制備TGFβ1-DC,應用多種分子生物學技術(RT-PCR,Western blot等)及免疫學技術研究TGFβ1基

4、因轉(zhuǎn)染對于DC發(fā)育分化、分子表型以及免疫功能的影響,檢測TGFβ1-DC刺激T細胞增殖的能力;TGFβ1-DC異體輸注Lewis大鼠后,以免疫組織化學檢測TGFβ1-DC的遷移路線和分布特征,TUNEL檢測受者脾T細胞凋亡以及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTHRT的表達.按Ono's方法建立大鼠同種異體心臟移植模型,觀察TGFβ1-DC輸注對于移植心臟排斥反應出現(xiàn)時間、反應級別以及存活時間的影響,以免疫組織化學方法觀察移植后相關趨化因子的表達和變化.

5、創(chuàng)新點及意義:1、結(jié)合以往小鼠DC培養(yǎng)經(jīng)驗,經(jīng)過改良,建立了大鼠DC的培養(yǎng)方法,并能穩(wěn)定擴增細胞得到足夠數(shù)量高純度的功能性DC,不僅節(jié)約了實驗成本,還推進了大鼠DC的深入研究.2、成功構(gòu)建了重組真核表達質(zhì)粒TGFβ1-pcDNA3,建立轉(zhuǎn)染大鼠DC的方法并控制TGFβ1的過表達,目前未見報道.3、發(fā)現(xiàn)TGFβ1-DC異體輸注可通過降低受者次級淋巴器官T細胞hTERT表達強度而誘導T細胞凋亡,抑制移植后排斥反應,未見文獻報道.4、發(fā)現(xiàn)TG