NF-KappaB SiRNA修飾樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠皮膚移植免疫耐受的研究.pdf

1、目的:探討NF-KappaB SiRNA修飾供體樹突狀細(xì)胞(DC)對異基因大鼠間皮膚移植術(shù)后免疫耐受誘導(dǎo)的效果,從而為該基因治療方法應(yīng)用于皮膚移植的臨床提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.PGPU6/GFP/Neo-siRNA-NF-κB表達(dá)載體的構(gòu)建。
　　 2.SD大鼠骨髓干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)DC:無菌手術(shù)取大鼠雙側(cè)的脛骨和股骨,髓腔沖洗液經(jīng)大鼠淋巴細(xì)胞分離液梯度離心分離出界面單核細(xì)胞,用RPMI-16

2、40完全培養(yǎng)基,rr-GM-CSF和rr-IL-4于37.0℃,5％的CO2培養(yǎng)箱中定向誘導(dǎo)培養(yǎng),隔天半量換液并加入rr-GM-CSF和rr-IL-4,培養(yǎng)六天后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 3.將NF-KappaB SiRNA及陰性對照SiRNA以LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染入大鼠DC,用RT-PCR和Western blot分別檢測NF-KappaB(NF-κB)基因和蛋白水平表達(dá)量的改變,驗(yàn)證所設(shè)計的siRNA的

3、抑制效應(yīng)。
　　 4.NF-KappaB SiRNA轉(zhuǎn)染的DC2×106個/只經(jīng)尾靜脈注入受鼠體內(nèi),5天后行皮膚移植,移植后5天部分受鼠移植皮膚送病理檢測,其余觀察皮膚存活時間,TUNEL法檢測移植皮膚淋巴細(xì)胞調(diào)亡情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.構(gòu)建的PGPU6/GFP/Neo-siRNA-NF-κB通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到DC后,能明顯抑制骨NF-κB基因和蛋白的表達(dá)。
　　 2.骨髓法分離的單核細(xì)胞培養(yǎng)六天后

4、,倒置顯微鏡可見未成熟的DC形態(tài),同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)中能刺激初始T細(xì)胞進(jìn)行增殖,NF-κB SiRNA修飾的DC能抑制T細(xì)胞的增殖。
　　 3.PGPU6/GFP/Neo-siRNA-NF-κB通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染DC18小時后,細(xì)胞開始出現(xiàn)綠色熒光,36小時后轉(zhuǎn)染率率可達(dá)60％。
　　 4.對照組,未修飾DC組,NF-κB SiRNA基因修飾DC組大鼠移植皮膚存活時間分別為(6.44±0.53)d,(7.19±0

5、.37)d,(17.63±2.34)d,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理,未修飾DC組與對照組之間無顯著性差異,而NF-KappaB SiRNA基因修飾DC組與對照組之間有顯著性差異;病理切片示:NF-KappaB SiRNA基因修飾DC組炎性細(xì)胞浸潤較對照組和未修飾DC組少,TUNEL試驗(yàn)示:NF-KappaBSiRNA基因修飾DC組移植皮膚可見淋巴細(xì)胞凋亡(細(xì)胞核呈現(xiàn)黃褐色)。
　　 結(jié)論：
　　 1.SD大鼠骨髓造血干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)