FasL和TGF-β1基因共修飾樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝移植已成為各種良性終末期肝病及早期、中期肝癌有效的治療方法，然而，急性排斥反應(yīng)(acute rejeetion，AR)仍是肝移植術(shù)后主要的并發(fā)癥之一。未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(immature dendritic cells，imDC)可誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞低反應(yīng)性并延長(zhǎng)移植器官的存活時(shí)間；但它可能在活體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境中接受成熟信號(hào)而被誘導(dǎo)成熟，甚至?xí)又嘏懦夥磻?yīng)。具有免疫抑制功能的單基因修飾imDC的基礎(chǔ)研究已證實(shí)可增強(qiáng)imDC誘導(dǎo)免疫耐受

2、的能力，也表現(xiàn)出一定的局限性，未能達(dá)到理想的免疫耐受狀態(tài)。本研究采用聯(lián)合具有不同免疫抑制功能的雙基因共同修飾imDC，以進(jìn)一步提高imDC誘導(dǎo)免疫耐受的能力，從而獲得受者的長(zhǎng)期生存。 目的: 聯(lián)合FasL和TGF-β1基因共修飾大鼠骨髓來(lái)源的imDC，旨在進(jìn)一步提高imDC誘導(dǎo)大鼠同種異體原位肝移植免疫耐受的能力，以延長(zhǎng)受鼠生存期。 方法: 1.建立改良的大鼠原位肝移植模型：在原二袖套法的基礎(chǔ)上，采用快速

3、切取供肝，一針?lè)ㄟB續(xù)縫合肝上下腔靜脈以及對(duì)出血點(diǎn)進(jìn)行熱止血等方法，進(jìn)行120例大鼠原位肝移植，并觀察術(shù)后存活率。 2.建立大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)模型：大鼠原位肝移植分3種移植組合：SD→SD組(同基因?qū)φ战M)，SD→Wistar組及DA→Lewis組，每組合20例。分別于術(shù)后3、5、7和10d各隨機(jī)處死4只，觀察外周血肝功能變化(ALT和TBIL)與肝臟病理改變，各組除外技術(shù)死亡的受鼠，將余受鼠留做生存分析。 3.培

4、養(yǎng)和誘導(dǎo)DA大鼠骨髓來(lái)源的DC，經(jīng)形態(tài)學(xué)、免疫表型及功能鑒定確認(rèn)后，將構(gòu)建好的pIRES2-EGFP-hFasL和plRES2-EGFP-hTGF-β1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到imDC，檢測(cè)hFasL和hTGF-β1的表達(dá)。 4.將空載體轉(zhuǎn)染的DA大鼠imDC分別從尾靜脈注射(尾靜脈注射組，20只)和腹腔注射(腹腔注射組，20只)至Lewis大鼠體內(nèi)，兩組分別于注射后第1d、2d、3d、5d及7d各時(shí)間點(diǎn)處死4只大鼠，取胸腺、脾臟、腹腔淋巴

5、結(jié)、肝臟及腎臟組織行冰凍切片，于熒光顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)并分析。 5.行以DA大鼠為供體、近交系Lewis大鼠為受體的同種異體原位肝移植140例，隨機(jī)均分為7組：未注射DC組(對(duì)照組)、mDC組、imDC組、空載體組、FasL組、TGF組及共轉(zhuǎn)染組；分別于移植前5d每天給Lewis大鼠腹腔注射mDC、imDC、空載體轉(zhuǎn)染的imDC、hFasL修飾的imDC、hTGF-β1修飾的imDC、hFasL和hTGF-β1共修飾的imDC各

6、2x106個(gè)，于肝移植術(shù)后3d、7d、10d各處死4只，觀察外周血肝功能變化(AtT和TBIL)，肝臟病理改變，肝、脾及腹腔淋巴結(jié)凋亡情況，外周血清細(xì)胞因子情況，各組除去技術(shù)死亡的受鼠，將余下受鼠作生存分析，死亡時(shí)取肝臟行病理組織學(xué)檢查。 結(jié)論: 1.經(jīng)改良的大鼠原位肝移植方法，手術(shù)時(shí)間短，成功率高，穩(wěn)定可靠，建立了比較穩(wěn)定的大鼠原位肝臟移植模型，適用于肝移植方面的基礎(chǔ)研究。 2.SD→Wistar組合的大鼠原位

7、肝移植模型雖可產(chǎn)生急性排斥反應(yīng)，但發(fā)展相對(duì)慢，且會(huì)出現(xiàn)自發(fā)性免疫耐受，因而并非肝移植急性排斥反應(yīng)基礎(chǔ)研究理想的動(dòng)物模型；DA→Lewis組合的大鼠原位肝移植術(shù)后肝臟病理改變、肝功能的變化及生存時(shí)間均符合臨床上肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的特點(diǎn)，是研究肝移植急性排斥反應(yīng)理想的動(dòng)物模型。 3.本實(shí)驗(yàn)?zāi)芘囵B(yǎng)、誘導(dǎo)、擴(kuò)增大量的DC。hFasL或hTGF-β1基因轉(zhuǎn)染均能夠獲得有效的表達(dá)，轉(zhuǎn)染后對(duì)imDC表型沒(méi)有明顯影響：可明顯降低imDC對(duì)同

8、種異體T淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性。聯(lián)合FasL和TGF-β1基因轉(zhuǎn)染的imDC在體外誘導(dǎo)同種異體免疫耐受的能力強(qiáng)于FasL或TGF-β1單基因轉(zhuǎn)染。 4.腹腔注射時(shí)imDC在體內(nèi)的分布主要以主動(dòng)遷移為主，速度相對(duì)慢，避免了尾靜脈注射時(shí)大量imDC快速分布在肝臟，以及切除受體肝臟時(shí)其內(nèi)的imDC丟失，該途徑適于肝移植免疫耐受的基礎(chǔ)研究。 5.imDC、hFasL或hTGF-β1單基因修飾imDC均未能誘導(dǎo)同種異體大鼠肝移植長(zhǎng)期存活