熱休克效應(yīng)對細胞的保護效應(yīng).pdf

1、目的：本實驗的內(nèi)容主要是對細胞進行熱休克預(yù)處理，用過氧化氫和加熱來研究熱休克效應(yīng)對物理和化學(xué)因子引起的細胞損傷的保護效應(yīng)，指標(biāo)主要有細胞的存活率和DNA雙鏈斷裂率。 研究目的為：(1)證實熱休克預(yù)處理對胚胎細胞是否有保護效應(yīng)。(2)證實熱休克預(yù)處理不但可以提高細胞存活率還可以減少細胞DNA的雙鏈斷裂。具體內(nèi)容為：(1)研究熱休克預(yù)處理對H<,2>O<,2>處理后的V79、NIH3T3細胞存活率的變化，觀察熱休克效應(yīng)是否可以提高胚

2、胎細胞的存活率。(2)研究熱休克處理對細胞DNA雙鏈斷裂的影響。(3)研究熱休克預(yù)處理對高溫引起的細胞DNA雙鏈斷裂的影響。 方法：實驗共分為三個部分：(1)培養(yǎng)NIH3T3和V79細胞，熱休克預(yù)處理后，采用不同濃度的H<,2>O<,2>處理細胞，不同恢復(fù)時間后，采用MTT法檢測細胞存活率。(2)培養(yǎng)NIH3T3細胞，經(jīng)37℃、39℃、42℃、43℃、45℃不同熱休克預(yù)處理溫度處理后，多聚甲醛固定，用抗γ-H2AX抗體孵育過夜，

3、再用結(jié)合FITC羊-抗-鼠第二抗體室溫下標(biāo)記，激光共聚焦顯微鏡下觀察DNA雙鏈斷裂所形成的斑點數(shù)量變化。(3)培養(yǎng)V79細胞，不同熱休克處理溫度和不同恢復(fù)時間，不同高溫處理后，固定，用抗γ-H2AX抗體孵育過夜，用結(jié)合FITC羊-抗-鼠第二抗體室溫下標(biāo)記，激光共聚焦顯微鏡下觀察DNA雙鏈斷裂所形成的斑點數(shù)量變化。 結(jié)果：(1)對于NIH3T3細胞，最好的實驗結(jié)果是熱休克預(yù)處理組可以比對照組提高細胞存活率40％左右，對于V79細胞

4、，最好的實驗結(jié)果是熱休克預(yù)處理組可以比對照組提高細胞存活率20％左右。不同熱休克預(yù)處理后恢復(fù)時間(大于2小時)對細胞的存活率沒有明顯影響。(2)細胞經(jīng)過熱休克處理后，立即固定，用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞：有多少DNA雙鏈斷裂點就可以在細胞中觀察到多少亮點，對照組有斑點細胞數(shù)小于細胞總數(shù)的5％。45℃條件下預(yù)處理后，在激光共聚焦顯微鏡下則可以觀察到所有細胞核中都有因DNA雙鏈斷裂而形成的斑點。39℃處理的細胞，核內(nèi)雙鏈斷裂的斑點無明顯增多

5、，有斑點的細胞數(shù)有少量增多。42℃處理的細胞有雙鏈斷裂斑點的細胞數(shù)和細胞核內(nèi)斑點增加不明顯，但經(jīng)過43℃處理的細胞，細胞核中有雙鏈斷裂的斑點的細胞和細胞核中的斑點數(shù)量都有顯著的增多。(3)細胞采用不同高溫，不同熱休克處理溫度，不同恢復(fù)時間處理后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)41℃熱休克預(yù)處理1小時可以顯著減少DNA雙鏈斷裂的量，為最佳熱休克處理條件。不同熱休克預(yù)處理溫度對細胞雙鏈斷裂的影響有顯著性差異，但不同恢復(fù)時間處理的細胞之間并未檢測到顯著性差異。