熱休克的細胞遺傳毒性研究.pdf

1、熱休克能引起許多與DNA半保留復制相關的細胞核功能的變化,包括了新的復制的起始,DNA在復制叉處的延長,新的組蛋白進入染色質過程中的合成和沉積,新合成DNA形成染色體的識別.熱休克,尤其當其溫度超過42℃時能引起細胞死亡,但是這其中的分子機制還不十分清楚.盡管有文獻報道DNA損傷有可能參與了熱休克殺傷細胞的過程,也有研究發(fā)現(xiàn)熱休克并不能誘導DNA的損傷.所以進一步研究熱休克導致細胞死亡的機制中是否有DNA損傷的參與是非常有必要的.

2、 單功能烷化劑甲基硝基亞硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine.MNNG)是一種在環(huán)境中廣泛存在的化學誘變劑和致癌劑.它是一種N-亞硝基化合物,屬于可直接與DNA作用的遺傳毒物,通過直接靶定DNA而誘發(fā)細胞產(chǎn)生遺傳毒性應激,并導致染色體異常、姐妹染色單體改變、點突變以及細胞死亡,是化學致癌物誘變機理研究中常用的一種模式化合物.此外,研究者們應角彗星實驗發(fā)現(xiàn)MNNG能誘導細胞DNA雙鏈斷裂的形成

3、. 近年來研究發(fā)現(xiàn),DNA雙鏈斷裂(DNA double strand breaks,DSBs)出現(xiàn)后,組蛋白家族成員H2AX C-端139位絲氨酸殘基(Ser)可被磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3.kinase,PI3K)樣家族成員磷酸化形成yH2AX(garoma-H2AX).γH2AX可以募集其它DNA修復蛋白到損傷位點,形成焦點(10ci)結構,共同完成DNA修復過程.在電離輻射(ioni

4、zing radiation,IR)后,在損傷位點快速形成γH2AX焦點,并且焦點的數(shù)量與IR造成的DSBs的數(shù)量存在一一對應關系,表明yH2AX焦點的形成可用于檢測IR誘導的DSBs.另外發(fā)現(xiàn),其它間接導致DSBs的遺傳毒物如順鉑、喜樹堿也誘導γH2AX焦點的形成.因此,直接或者間接導致的DSBs的產(chǎn)生都能誘導γH2AX焦點的形成.γH2AX焦點與DSBs之間的密切關系表明γH2AX極有可能成為檢測細胞DNA損傷特別是DSBs的一個新

5、的特異性指標. 鑒于以上原因,為了進一步研究熱休克能否引起細胞的遺傳毒性,我們用γH2AX作為DNA損傷的指標,對熱休克的遺傳毒性進行了系統(tǒng)研究. 熱休克可降低細胞的生存率熱休克(45℃,30 min)處理CHL、HeLa細胞后,間隔不同時間,用MTT法檢測細胞的存活率.結果發(fā)現(xiàn):熱休克45℃,30 min可使CHL、HeLa細胞的存活率下降.將細胞放置于37℃繼續(xù)孵育并不能逆轉熱休克后生存率下降的趨勢,在熱休克后0.5

6、、2、8和24 h,CHL、Hel_丑細胞的存活率與未經(jīng)熱休克處理的對照組相比也是降低的,并且隨著時間的延長與對照組相比細胞的相對生存率降低. 免疫熒光實驗證明熱休克不能在HeLa或CHL細胞中誘導γH2AX焦點的形成HeLa或CHL細胞在45℃熱休克30 min后繼續(xù)在37℃孵育0、0.5、2和8 h后,與空白對照組相比CHL細胞中γH2AX焦點的數(shù)量無明顯變化,仍然是多數(shù)細胞無γH2AX焦點的存在,少部分細胞中含有1-10或

7、更多的焦點.這表明熱休克不能誘導γH2AX焦點的形成. 熱休克不能在p53缺失細胞中誘導γH2AX焦點形成p53在維持細胞基因組的穩(wěn)定性中發(fā)揮著重要作用,因此我們進一步探討p53的缺失可否影~H2AX焦點的形成.為此我們采用了U2OSE6tet24細胞.此種細胞在培養(yǎng)基中有四環(huán)素存在的情況下,p53有正常的表達,在缺乏四環(huán)素的時候則無p53的表達.我們發(fā)現(xiàn),在p53缺失的情況下熱休克處理后γH2AX焦點的數(shù)目并沒有增多,表明熱休

8、克不能在p53缺失的細胞中誘導YH2AX焦點的形成. 熱休克不能在FENl缺失細胞中誘導yH2AX焦點的形成FENl在DNA復制和修復中起了非常重要的作用,我們發(fā)現(xiàn)FEN1的缺失可以導致基因組不穩(wěn)定,并且能夠增強MNNG的細胞毒性反應,因此我們選用此種細胞來進一步檢測FEN1的缺失是否會影響由熱休克所引起的細胞的YH2AX焦點形成.結果發(fā)現(xiàn),在FEN1缺失細胞中,熱休克處理后yH2AX的數(shù)目較之空白對照組沒有增多.表明熱休克不能

9、誘導FENl缺失細胞產(chǎn)γH2AX焦點. 熱休克預處理可抑制MNNG誘導的γH2AX焦點的形成為了進一步研究熱休克與其他藥物協(xié)同作用后對細胞γH2AX焦點形成的影響,我們觀察了熱休克預處理后MNNG誘導細胞γH2AX焦點的情況.1μg/mlMNNG在FL、CHL細胞中作用2 h能強烈誘導γH2AX焦點的形成.然而,當FL、CHL細胞在45℃熱休克30 min后再進行1μg/ml MNNG處理2 h,用免疫熒光和流式細胞儀檢測的到的

10、結果都顯示YH2AX焦點數(shù)目與熒光強度都較之單純MNNG處理組降低. 熱休克后處理不影響MNNG誘導的γHZAX焦點的形成因為熱休克預處理可影響MNNG誘導的γH2AX焦點的形成,所以我們進一步探討對于已經(jīng)被MNNG誘導產(chǎn)生的γH2AX焦點,熱休克是否也能夠使其數(shù)目減少或者熒光度降低.實驗結果顯示在MNNG誘導產(chǎn)生γH2AX焦點后再進行熱休克(45℃,30 min),通過免疫熒光和流式細胞儀對γH2AX焦點進行檢測,其數(shù)目和熒光

11、強度并沒有減少或者降低. 結論:第一,熱休克后細胞的生存率降低,說明熱休克具有細胞毒性.第二,熱休克后在CHL、HeLa細胞中用免疫熒光及流式細胞儀都檢測不到YH2Ax的增多,并且在p53缺失以及FEN1缺失的細胞中也是如此,說明熱休克不能誘導CHL、HeLa產(chǎn)生γH2AX,p53和FEN1也并不參與熱休克影響細胞產(chǎn)生γH2AX的過程.第三,熱休克預處理減少了MNNG誘導的γH2AX焦點的形成,說明熱休克可影響MNNG誘導細胞產(chǎn)