大鼠SE后海馬XIAP、Smac、HtrA2和XAF1的表達(dá)及槲皮素的影響.pdf

1、背景和目的： 癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)是醫(yī)學(xué)上的急癥之一，可引起急性和持久性腦部神經(jīng)系統(tǒng)損害，尤其易致海馬等邊緣系統(tǒng)的神經(jīng)元損傷，促進(jìn)癲癇的形成和發(fā)展，導(dǎo)致腦功能障礙。細(xì)胞凋亡是SE后腦神經(jīng)元死亡的形式之一。半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的關(guān)鍵作用。X-連鎖凋亡蛋白(XIAP)是凋亡抑制蛋白家族中作用最強(qiáng)、功能最全面的caspase抑制因子，發(fā)揮著抗凋亡作用

2、。XIAP對(duì)caSpase的抑制作用，還受到Smac、HtrA2、XAF1因子的負(fù)性調(diào)控。已發(fā)現(xiàn)XIAP及其負(fù)性調(diào)控因子參與了腦缺血、腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元損傷的病理生理機(jī)制。但目前，國(guó)內(nèi)外尚缺乏XIAP及其負(fù)性調(diào)控因子參與SE后神經(jīng)元損傷的病理生理機(jī)制研究。研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激參與XIAP通路的調(diào)控，SE也存在氧化應(yīng)激。槲皮素(Quercetin，Que)具有抗氧化作用，保護(hù)氧化應(yīng)激反應(yīng)中受損的組織細(xì)胞，但未見應(yīng)用于SE的研究報(bào)道。設(shè)想：槲皮素可

3、通過影響XIAP的調(diào)節(jié)來發(fā)揮抗凋亡、保護(hù)神經(jīng)元的作用。本研究觀察SE后海馬XIAP、Smac、HtrA2、XAF1的表達(dá)變化及槲皮素的影響，探討XIAP及其負(fù)性調(diào)控因子參與SE后的病理生理機(jī)制及槲皮素的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，為SE后的神經(jīng)元保護(hù)提供新思路、新方法。 方法：健康成年雄性SD大鼠分批隨機(jī)分為對(duì)照組、SE模型組、槲皮素干預(yù)組。建立氯化鋰.匹羅卡品致癇大鼠SE模型。選擇SE后2h、4h、8h、24h、72h作為研究時(shí)間點(diǎn)。取大鼠

4、海馬組織作為研究部位。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)海馬CA1、CA3區(qū)的XIAP、Smac、HtrA2、XAF1 及 caspase-3 蛋白的表達(dá)；Western blot檢測(cè)海馬組織XIAP、Smac、HtrA2及caspase-3蛋白量的表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)海馬組織XIAP mRNA的表達(dá)；Nissl染色檢測(cè)存活神經(jīng)元，TUNEL方法檢測(cè)原位神經(jīng)元凋亡。 結(jié)果： 1.氯化鋰-匹羅卡品致癇大鼠SE模型：SE誘發(fā)成功率8

5、6.6％，模型成功率 76.6％，致癇死亡率10.0％。 2.XIAP mRNA 及蛋白的表達(dá)：海馬神經(jīng)元XIAP蛋白表達(dá)，在對(duì)照組散在分布于細(xì)胞漿的核周圍區(qū)，SE 后呈彌散性分布于整個(gè)神經(jīng)元內(nèi)。與對(duì)照組比較，SE組CA1、CA3區(qū)XIAP蛋白表達(dá)在2h開始逐漸增高，8h達(dá)高峰(P<0.01)，72h明顯下降。槲皮素組與SE組比較，CA1、CA3區(qū)XIAP蛋白表達(dá)在2h、4h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在8h，24h點(diǎn)高于

6、SE組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)(P<0.05，P<0.01)。Western blot顯示，SE組XIAP蛋白表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組比較，SE組海馬XIAP mRNA表達(dá)水平在2h、4h、8h上調(diào)(P<0.01)，24h后下調(diào)。槲皮素組與SE組比較，海馬XIAP mRNA表達(dá)水平在2h、4h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在8h，24h高于SE組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)(P<0.05，P<0.01)。 3.Smac蛋白的表達(dá)：

7、海馬神經(jīng)元Smac蛋白表達(dá)，在對(duì)照組很弱，SE 后呈彌散性分布于整個(gè)神經(jīng)元內(nèi)。SE組CA1、CA3區(qū)2～24h表達(dá)逐漸增高，72h 表達(dá)有所下降。Western blot顯示海馬組織胞漿Smac蛋白表達(dá)量，與對(duì)照組比較，SE組2～24h逐漸增加(P<0.01)，72h有所下降。 4.HtrA2 蛋白的表達(dá)：海馬神經(jīng)元HtrA2蛋白表達(dá)，在對(duì)照組很弱，SE后呈彌散性分布于整個(gè)神經(jīng)元內(nèi)；SE組CA1、CA3區(qū)HtrA2蛋白表達(dá)在2～

8、24h逐漸增高，72h有所下降。Western blot顯示海馬組織胞漿HtrA2蛋白表達(dá)量，與對(duì)照組比較，SE組2～72h明顯增加(P<0.01)。 5.XAF1蛋白的表達(dá)：海馬神經(jīng)元XAF1蛋白表達(dá)，在對(duì)照組很少，SE組CA1、CA3區(qū)2～24h表達(dá)逐漸增加，72h表達(dá)有所下降。 6.caspase-3活性蛋白的表達(dá)：海馬神經(jīng)元caspase-3活性蛋白，在對(duì)照組未見表達(dá)，在SE組CA1、CA3區(qū)4～24h表達(dá)逐漸增

9、加，72h表達(dá)有所下降。槲皮素組與SE組比較，CA1、CA3區(qū)caspase-3活性蛋白表達(dá)在2h、4h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在8h，24h、72h點(diǎn)低于SE組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)(P<0.05，P<0.01)。Western blot顯示海馬組織caspase-3 活性蛋白表達(dá)量，與對(duì)照組比較，SE組4～72h明顯增加(P<0.01)。 7.神經(jīng)元凋亡檢測(cè)：對(duì)照組海馬CA1、CA3區(qū)未見TUNEL陽性細(xì)胞。SE組CA1、CA3

10、區(qū)的TUNEL陽性細(xì)胞，在4h開始增加，24h 達(dá)高峰，72h下降。槲皮素組與SE組比較，CA1、CA3區(qū)的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)在2h、4h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在8h，24h、72h點(diǎn)少于SE組相應(yīng)時(shí)點(diǎn)(P<0.05，P<0.01)。 8.海馬神經(jīng)元損失分析：SE組CA1、CA3區(qū)存活神經(jīng)元數(shù)在4～72h逐漸少于對(duì)照組(P<0.01)。槲皮素組CA1、CA3區(qū)的存活神經(jīng)元數(shù)在8～72h也逐漸少于對(duì)照組(P<0.01)，但在