α-干擾素和全反式維甲酸誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞XAF1表達(dá)及調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、南方醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文α-干擾素和全反式維甲酸誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞XAF1表達(dá)及調(diào)控機(jī)制的研究姓名：羅曉勇申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：張積仁20080420中文摘要甲酸類化合物是良好的誘導(dǎo)分化劑，干擾素具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。Y 一干擾素( i n t e r f e r o n - Y ，) 、全反式維甲酸( a l l —t r a n s r e t i n o i ca c i d ，A T R A ) 可以通過調(diào)節(jié)某

2、些抗凋亡基因，促進(jìn)某些腫瘤細(xì)胞凋亡，干擾素與維甲酸聯(lián)合應(yīng)用可以增加抗腫瘤療效，成為治療惡性腫瘤新近研究熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞株S W l 1 1 6 為靶細(xì)胞，以I F N 一0 和A T R A為刺激因子，從蛋白活性、m R N A 、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平及信號傳導(dǎo)方面等不同層次深入進(jìn)行了I F N - Q 和A T R A 對結(jié)腸癌細(xì)胞X A F I 基因表達(dá)及轉(zhuǎn)錄凋控的影響及其分子機(jī)制的研究，并探討X A F lJ

3、下反義寡核苷酸在I F N - Q 和A T R A 介導(dǎo)S W l 11 6細(xì)胞凋亡中的作用。為進(jìn)一步深入研究X A F l 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為X A F l 基因的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)方法：1 ) I F N - Q 和A T R A 作用f ；{ 『后X A F l 表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性的測定。選取結(jié)腸癌細(xì)胞株S W l l l 6 為研究對象，應(yīng)用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( R e v e r s e t r a n s

4、 p c r i p t i o n p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ，R T —P C R ) 和蛋白免疫印跡( W e s t e r nB l o t t i n g ，W B ) 從m R N A 和蛋白表達(dá)兩個(gè)水平檢測X A F l 的差異表達(dá)。為進(jìn)行X A F l 基因轉(zhuǎn)錄活性的檢測，我們克隆了一個(gè)位于X A F l 基因5 ’側(cè)翼區(qū)的調(diào)節(jié)片段，該片段含有X A F

5、I 基因的核心啟動(dòng)子( 一1 0 7 b p ～+ 1 6 4 b p ) ，在這里臨近翻譯初始密碼子A T G 上游的核苷酸定義為一l 。設(shè)計(jì)引物序列如下：上游引物5 ’一G A T C T C C T C U T C C C T G 從一3 ’，] ：游弓l 物5 ’一G T C T C C A G C T G C T T G T C C T C 一3 ’，K p n I 酶切位點(diǎn)加入到上游引物的5 ’端，X h o l 酶切位點(diǎn)加

6、入到下游引物中。以L o v o 細(xì)胞的基因組D N A 為摸板采用H o t s t a r tT a q 酶進(jìn)行P C R 擴(kuò)增。經(jīng)K p n I 和X h 0 1 分別雙酶切載體p G L 3 - b a s i c 和P C R 產(chǎn)物后，將純化的P C R 產(chǎn)物插入到p G L 3 一b a s i c 載體的熒光素酶報(bào)告基因上游方向上構(gòu)建成啟動(dòng)子熒光素酶重組質(zhì)粒( p L U C l 0 7 ) 。含有X A F l 啟動(dòng)子報(bào)