轉(zhuǎn)CpTI基因蘋(píng)果特異蛋白質(zhì)分析和抗蟲(chóng)性株系的篩選.pdf

1、本研究以轉(zhuǎn)豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CowpeaTrypsinInhibitor,CpTI)蘋(píng)果(MalusdomesticaBorkh)組培苗和相對(duì)敏感品系的棉蛉蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)為試材，采用葉片蛋白質(zhì)的等電聚焦電泳和毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析，研究了外源基因在植株體內(nèi)蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)；同時(shí)以飼喂幼蟲(chóng)的方式，分析幼蟲(chóng)的較正死亡率和蟲(chóng)體內(nèi)的類胰凝乳蛋白酶活力的變化，初步篩選出具有抗蟲(chóng)特性的蘋(píng)果株系。轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果品種為嘎拉

2、、王林、喬納金、富士，為經(jīng)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉圓片轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化高效啟動(dòng)子啟動(dòng)的CpTI基因轉(zhuǎn)化株系。其中嘎拉品種選用46個(gè)株系，編號(hào)為1～46；王林9個(gè)株系編號(hào)為47～55；喬納金3個(gè)株系編號(hào)為56～58；富士2個(gè)株系編號(hào)為59，60。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.較為優(yōu)化的適宜蘋(píng)果葉片蛋白質(zhì)的等電聚焦電泳程序?yàn)椋翰捎酶牧急恋矸ㄌ崛√O(píng)果葉片蛋白質(zhì)；電泳過(guò)程中聚丙烯酰胺凝膠濃度為3.66﹪，兩性電解質(zhì)范圍為3.5～9.0，濃度為2﹪，每

3、管加樣蛋白質(zhì)量為33.8μg；電泳：恒壓100V，10min；恒壓500V，10min；恒壓750V，3h30min；電泳后考馬斯亮藍(lán)R-250染色，先固定再染色。 2.等電聚焦結(jié)果顯示：嘎拉株系中2，8，11，12，14，19，27，31，32，33，34，36共12個(gè)株系在pH值6.18～6.30之間發(fā)現(xiàn)有一特異條帶；王林品種4個(gè)株系的電泳結(jié)果與對(duì)照有差異，分別為47，50，51，55在pH值6.18～6.30之間有一特異條

4、帶；富士59在pH值6.18～6.30之間發(fā)現(xiàn)有一特異條帶；喬納金品種中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有特異條帶出現(xiàn)。 3.較為優(yōu)化的適宜蘋(píng)果葉片蛋白質(zhì)的毛細(xì)管電泳程序：采用改良丙酮沉淀法提取蛋白質(zhì)，電泳過(guò)程中溫度為25℃，電壓為20kV，0.5psi進(jìn)樣5s，電泳時(shí)間為17min，檢測(cè)波長(zhǎng)在280nm處的蛋白質(zhì)區(qū)帶。電泳結(jié)果表明：與對(duì)照相比嘎拉株系12，19，32，39在第7.65分鐘分別出現(xiàn)一條特異峰帶。 4.蟲(chóng)試結(jié)果顯示：部分轉(zhuǎn)CpTI

5、基因蘋(píng)果株系有較強(qiáng)的殺蟲(chóng)和抑蟲(chóng)作用，株系最高蟲(chóng)試死亡率是100﹪，為株系32，51。其中較正死亡率為正值的株系共28個(gè)，分別為：2，4，8，9，10，11，12，13，16，17，19，21，24，27，31，32，33，34，36，39，43，47，50，51，55，56，58和59，其中株系2，12，27，31，32，34，39，50，51，56較正死亡率大于等于50﹪，表明這些株系有明顯的殺蟲(chóng)和抑蟲(chóng)效果，并且經(jīng)秩合檢驗(yàn)分析，喂食2

6、7，31，32和51的蟲(chóng)重與對(duì)照蟲(chóng)重相比差異顯著，表明株系27，31，32，51有明顯抑制幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的作用。 5.喂食轉(zhuǎn)CpTI基因蘋(píng)果組培苗的棉蛉蟲(chóng)體內(nèi)類胰凝乳蛋白酶活性變化的測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明：部分轉(zhuǎn)基因株系有明顯的抑制蟲(chóng)體內(nèi)類胰凝乳蛋白酶活性的作用，但部分株系抑制能力較弱甚至沒(méi)有抑制能力。以轉(zhuǎn)基因苗株系喂食棉蟲(chóng)幼蟲(chóng)，共9個(gè)株系使蟲(chóng)體內(nèi)的蛋白酶活性的變化與對(duì)照相比差異顯著，為株系4，10，12，32，39，43，47，50和56