日本乙型腦炎病毒E蛋白多表位基因串聯(lián)表達(dá)及免疫效力研究.pdf

1、日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，又稱(chēng)乙型腦炎病毒，簡(jiǎn)稱(chēng)乙腦病毒，屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬，主要引起人類(lèi)或馬的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染以及豬的流產(chǎn)，能通過(guò)持續(xù)感染的蚊子傳播給人，并且主要在脊椎動(dòng)物宿主內(nèi)存在，特別是具有較高病毒血癥的豬和鳥(niǎo)類(lèi)，在人類(lèi)乙腦主要引起致死率較高的腦炎，致死率從20-50％，但是絕大多數(shù)的幸存者都具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的后遺癥；豬是主要中間宿主和擴(kuò)散宿主

2、，也是主要的傳染源。許多研究表明，豬流行性乙型腦炎與人流行性乙型腦炎密切相關(guān)，因此預(yù)防豬感染本病是防止人患乙腦的重要措施。同時(shí)，乙腦也是豬的重大疫病之一，能引起懷孕母豬流產(chǎn)、死胎及弱仔，公豬睪丸炎，仔豬呈神經(jīng)癥狀，其暴發(fā)常給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前用于JEV預(yù)防的疫苗主要是傳統(tǒng)的滅活苗和弱毒苗，乙腦弱毒疫苗和滅活疫苗等常規(guī)疫苗都具有良好的免疫原性，在預(yù)防和控制乙腦的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但是鼠腦來(lái)源的乙腦滅活疫苗在過(guò)敏問(wèn)題上越來(lái)越

3、突出，而且使用滅活疫苗的一個(gè)主要問(wèn)題是缺乏長(zhǎng)效免疫，由于需要多次重復(fù)免疫，使得免疫程序繁瑣。弱毒疫苗則存在病毒毒力返強(qiáng)的不安全因素，因此尋求穩(wěn)定、安全以及新型的JE疫苗已經(jīng)成為近年JE感染防治的主要研究方向。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，JE基因工程疫苗等多種新型的疫苗都在不斷的研究開(kāi)發(fā)中。 本研究首次構(gòu)建了乙腦E蛋白多表位串聯(lián)基因(TEP)，包括E蛋白上四個(gè)重要的B細(xì)胞表位327aa～333aa，337aa～345aa

4、，373aa～399aa，397aa～403aa和兩個(gè)T細(xì)胞表位60～68aa，436aa～445aa。為了提高免疫效力，在六個(gè)表位串聯(lián)的基礎(chǔ)上引入了組織酶原激活物信號(hào)肽序列(tissue plasminogen activator，TPA)、CpG基序和通用型輔助性T細(xì)胞表位。本研究分別以原核表達(dá)體系、真核表達(dá)體系及腺病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了TEP基因，并比較了它們的免疫效力。論文的主要研究?jī)?nèi)容主要包括以下幾個(gè)方面： 1.乙腦E蛋白

5、多表位基因串聯(lián)真核質(zhì)粒的構(gòu)建。 人工合成含有JEV E基因的T，B細(xì)胞表位的多表位基因，插入真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.0中構(gòu)建重組真核質(zhì)粒pCDNA-TEP。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，利用間接免疫熒光證明pCDNA-TEP在真核細(xì)胞內(nèi)能有效的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；Western-blot檢測(cè)表明重組真核質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物能與JEV陽(yáng)性血清特異性結(jié)合，證明其具有一定的生物學(xué)活性和抗原性。 2.乙腦E蛋白多表位基因在大腸桿菌中的融合表達(dá)。

6、 以重組質(zhì)粒pUC-TEP為模板，擴(kuò)增不合TPA信號(hào)肽序列的基因片段，將其克隆至原核表達(dá)載體pET-32a(+)，命名為pET-rEP。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，酶切鑒定的陽(yáng)性菌經(jīng)1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h后，將大腸桿菌以6000rpm離心10min，用PBS洗兩次，收集細(xì)菌，將其懸浮在PBS中，進(jìn)行超聲波破碎，以10，000 rpm離心20min，將上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE

7、電泳分析，結(jié)果表明這種蛋白以包涵體形式存在。將包涵體在8M的尿素中過(guò)夜溶解，然后將上清過(guò)His Bind樹(shù)親和層析柱對(duì)重組表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。結(jié)果顯示融合蛋白的分子量為37kDa，Western blot表明重組蛋白具有抗JEV的特異抗原性。 3.多表位DNA疫苗和重組蛋白疫苗對(duì)Balb/c小鼠的特異性免疫影響。 為了評(píng)價(jià)所構(gòu)建的DNA疫苗和重組蛋白質(zhì)疫苗的免疫效力，將6周齡Balb/c小鼠隨機(jī)分成4組，每組8只，設(shè)pcD

8、NA-TEP(1)，pET-rEP(2)，pcDNA-TEP+pET-rEP(3)，滅活疫苗(4)共4個(gè)免疫組，同時(shí)設(shè)pcDNA3.0空載體對(duì)照組(5)。肌肉注射免疫，重組質(zhì)粒的免疫劑量為50μg/只，重組蛋白的免疫劑量為200 pmol/只，滅活苗免疫組按照使用說(shuō)明進(jìn)行。利用微量中和試驗(yàn)檢測(cè)免疫后的中和抗體，利用商品化的ELISA試劑盒檢測(cè)免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2及IL-4的能力，并與滅活苗進(jìn)行比較。結(jié)果表明，試驗(yàn)

9、構(gòu)建的DNA疫苗和重組蛋白質(zhì)疫苗都能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)JEV的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。滅活苗免疫組產(chǎn)生了最高的中和抗體，其次由高到低依次為，pcDNA-TEP+pET-rEP，pET-rEP，pcDNA-TEP。pcDNA3.0空載體對(duì)照組沒(méi)有檢測(cè)到特異性針對(duì)JEV的中和抗體。通過(guò)對(duì)抗體亞型及細(xì)胞因子的測(cè)定，pET- rEP和滅活苗免疫組主要是增強(qiáng)Th2免疫反應(yīng)，pcDNA-TEP增強(qiáng)Th1免疫反應(yīng)，而pcDNA-TEP+pET-rEP

10、則產(chǎn)生Th1/Th2混合型的免疫反應(yīng)。這為研究能夠更好地防制JEV感染的新型疫苗提供新的思路。 4.表達(dá)乙腦E蛋白多表位基因重組腺病毒的構(gòu)建。 將人工合成多表位基因克隆到腺病毒的穿梭載體pAdeno Vator-CMV5-IRES-GFP中。得到的陽(yáng)性穿梭質(zhì)粒經(jīng)Pme I酶線性化后，利用電轉(zhuǎn)化技術(shù)將線性化的質(zhì)粒與腺病毒骨架載體pAdeno Vator△E1/E3共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，使其在大腸桿菌中進(jìn)行同

11、源重組。將篩選到的重組病毒質(zhì)粒經(jīng)Pac I酶線性化后暴露出包裝信號(hào)，通過(guò)脂質(zhì)體Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞后得到重組病毒。利用報(bào)告基因GFP檢測(cè)病毒滴度，通過(guò)PCR和western-blot檢測(cè)JEV多表位基因得到成功的表達(dá)并有很好的免疫原性，重組病-rAd5-TEP的滴度為1010.59個(gè)TCID50/mL。重組病毒經(jīng)過(guò)連續(xù)五代傳代后效價(jià)穩(wěn)定。 5.重組腺病毒對(duì)小鼠特異性免疫的影響。 6周齡

12、小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。將重組病毒rAd5-TEP、滅活疫苗分別以腹腔接種的方式給小鼠進(jìn)行3次免疫，同時(shí)設(shè)對(duì)照組小鼠，免疫PBS。然后通過(guò)測(cè)定IgG1、IgG2a、中和抗體和IL-4、IFN-γ水平來(lái)衡量重組病毒的免疫效果。結(jié)果表明重組病毒rAd5-TEP既能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答又能誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，抗體亞型測(cè)定結(jié)果顯示，重組病毒rAd5-TEP既能誘導(dǎo)IgG1的分泌又能誘導(dǎo)IgG2a的分泌，但以IgG2a為主。同時(shí)細(xì)胞因子ELISA試

13、驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明重組病毒主要刺激Th1分化(IFN-γ)，但與滅活苗相比，也能刺激Th2(IL-4)的分化。pcDNA-TEP+rAd5-TEP免疫組能產(chǎn)生最高水平的IFN-γ和IL-4，而誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體滴度略低于滅活苗免疫組。 6.不同疫苗聯(lián)合應(yīng)用對(duì)豬的免疫效力研究。 為了比較pcDNA-TEP+pET-rEP和pcDNA-TEP+rAd5-TEP對(duì)豬的免疫效力，將4周齡的健康仔豬隨機(jī)分4組，每組5頭，設(shè)pcDNA

14、-TEP+pET-rEP(Ⅰ)、pcDNA-TEP+ rAd5-TEP(Ⅱ、)與滅活疫苗(Ⅲ)3個(gè)免疫組，同時(shí)PBS空白對(duì)照組(Ⅳ)。肌肉注射免疫，重組質(zhì)粒的免疫劑量為200μg/頭，重組蛋白的免疫劑量為800 pmol/頭，重組病毒免疫組免疫劑量為1×1010TCID50/頭，滅活苗免疫組按照使用說(shuō)明進(jìn)行，空白對(duì)照組每頭注射2mL高壓滅菌的PBS，4周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫。初次免疫后每隔2周采血分離血清，利用空斑抑制中和試驗(yàn)(PRNT)檢測(cè)

15、JEV特異性中和抗體水平；同時(shí)，在初次免疫后30、45與60天，無(wú)菌采血，分離血血清，采用ELISA定量檢測(cè)細(xì)胞因子的水平。結(jié)果表明，pcDNA-TEP+rAd5-TEP免疫組在加強(qiáng)免疫后2周產(chǎn)生了可檢測(cè)到的中和抗體，pcDNA-TEP+pET-rEP和滅活疫苗免疫組在加強(qiáng)免疫后4周檢測(cè)到中和抗體，在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，滅活疫苗免疫組產(chǎn)生的中和抗體平均滴度最高；就細(xì)胞免疫而言，初次免疫后30天，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞因子的產(chǎn)量沒(méi)有明顯差異；在初次免疫

16、后45天，3個(gè)試驗(yàn)組IFN-γ與IL-2的產(chǎn)量明顯增多，pcDNA-TEP+rAd5-TEP產(chǎn)生最高水平的IFN-γ、IL-2和IL-4，在免疫后70d，各組IFN-γ與IL-2的產(chǎn)量沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明加強(qiáng)免疫后Th1型細(xì)胞因子的分泌至少可以維持3周，滅活苗免疫后，IFN-γ、IL-2都不明顯，主要是IL-4的產(chǎn)量增加。上述研究結(jié)果表明以pcDNA-TEP作基礎(chǔ)免疫，以rAd5-TEP加強(qiáng)免疫的“prime-boost”疫苗是一個(gè)值得深