銀杏內(nèi)生真菌分離鑒定及其抗菌抗氧化作用研究.pdf

1、內(nèi)生真菌是一類生長于活體植物組織中的特殊的真菌,研究相對較少。從生長于獨特環(huán)境中、具有藥用價值、樹齡長或有地域特色的植物中一般都能分離出新的內(nèi)生菌,而新種或罕見菌種又能為尋找新型生物活性物質(zhì)提供前景。 銀杏是我國特色珍稀植物,具有“活化石”之美稱。銀杏在生長期間很少感染病蟲害,壽命板長,因此具有很好的挖掘新型內(nèi)生真菌的潛力。本研究采集江蘇省泰興市、邳州市古銀杏枝條和樹葉,采用組織分離法分離其中的內(nèi)生真菌,篩選具有抗菌活性的菌株并

2、通過形態(tài)特征或內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列分析進行初步鑒定；對其中一株抗菌活性顯著且穩(wěn)定的不產(chǎn)孢菌進行形態(tài)學研究和分子解析,對培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化,進而分離其發(fā)酵產(chǎn)物中的抗菌活性物質(zhì)并進行結(jié)構(gòu)鑒定；并研究子座的抗氧化活性,為進一步工業(yè)化生產(chǎn)應用提供工作基礎和依據(jù)。主要研究結(jié)果如下： 1.采用水瓊脂平板和孟加拉紅培養(yǎng)基從銀杏枝條、樹葉樣品中分離得到55株內(nèi)生真菌,其中29株為孟加拉紅法分離所得,大部分為產(chǎn)孢真菌,包括1株交鏈

3、孢霉、6株曲霉、10株青霉、1株毛霉、1株鐮孢霉、9株不產(chǎn)孢真菌和1株酵母；26株為水瓊脂法所得,包括1株青霉、3株交鏈孢霉、3株簡梗孢霉和19株不產(chǎn)孢真菌。 2.通過平板孔阱試驗篩選具有抗菌活性的內(nèi)生真菌,共得到23株具有不同程度抗菌活性的菌株,占總分離株數(shù)的41.82％。水瓊脂法分離所得菌株的活性明顯高于孟加拉紅方法。 3.對用水瓊脂法分離所得的11株活性菌株進行初步鑒定。根據(jù)分生孢子形態(tài)對其中4株產(chǎn)孢菌進行鑒定,Y

4、X-2屬于簡梗孢霉屬(Chromosporium sp.)、YX-9屬于小單頭孢霉屬(Acremoniella sp.)、YX-30和YX-45均為交鏈孢霉(Alternaria spp.)。通過對內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)進行序列分析,另外7株不產(chǎn)孢活性菌株中YX-16、YX-44與細交鏈孢霉、YX-13與磚紅鐮孢霉、YX-27、YX-28、YX-41與炭角菌、YX-47與一株分離自Picea glauca的未鑒定的內(nèi)生菌分別具有較高的相

5、似性,結(jié)果與形態(tài)特征比較的結(jié)果一致。 4.對抗菌活性顯著且穩(wěn)定的不產(chǎn)孢真菌YX-28進行深入的形態(tài)和分子鑒定。YX-28在多種培養(yǎng)基上產(chǎn)生黑色炭化菌落和指狀子座組織,但經(jīng)過各種誘導產(chǎn)孢處理都不能產(chǎn)生有性或無性孢子。對18S rDNA和ITS片段進行分子解析,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,可將YX-28菌株歸屬為木內(nèi)炭角菌Xylaria hypoxylon的近緣種。 5.通過Custom Design設計,研究適宜Xylaria sp.

6、YX-28子座生長的條件為棉籽殼：麥麩基質(zhì)固液比為30:70(W/V)、以塑料膜封口、黑暗培養(yǎng)富集菌絲、弱散射光照射刺激子座產(chǎn)生,在該條件下子座產(chǎn)量平均為441.96g/m2。 6.采用單因素試驗法確定了Xylaria sp.YX-28液體搖瓶培養(yǎng)的最佳生長條件,該菌最適生長溫度為25℃,適宜生長溫度范圍為5℃～37℃,高于37℃或低于5℃該菌停止生長；適宜生長的pH范圍為3～12,且在pH為6時,菌絲生物量和產(chǎn)物活性最高；搖瓶

7、培養(yǎng)的最適裝液量為150mL/500mL,接種量為2.5g菌絲/150mL。 7.采用析因設計和中心組合設計對Xylaria sp.YX-28的液體培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化,蛋白胨和硫酸鋅的濃度是影響 Xylaria sp.YX-28發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性的關鍵因子,優(yōu)化所得的最優(yōu)培養(yǎng)基組合為1.500％葡萄糖、0.200％NH4Cl、0.500％黃豆粉、0.158％蛋白胨和0.168％ZnSO4,Xylaria sp.YX-28發(fā)酵產(chǎn)物對

8、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌活性與優(yōu)化前相比分別提高了1.44和2.02倍。 8.Xylaria sp.YX-28的大規(guī)模發(fā)酵液通過膜分離處理,抗菌活性最大的組分以乙酸乙酯萃取,浸膏通過薄層層析、柱層析、制備液相技術等分離純化,得到的純化組分經(jīng)光譜手段鑒定為7-氨基-4-甲基香豆素。 9.抗菌試驗結(jié)果表明,7-氨基-4-甲基香豆素對受試的10株細菌、1株酵母和2株霉菌均表現(xiàn)出良好的抑制效果,與陽性對照相比活性相當,且具

9、有更廣的抗菌譜。 10.研究了Xylaria sp.YX-28子座提取物的抗氧化能力,提取物中總酚、總黃酮含量與抗氧化活性之間都存在明顯的正相關性,相關系數(shù)R2分別為0.7336、0.9392,甲醇提取物具有最高的總酚、總黃酮含量和最強的清除自由基能力。在β-胡蘿卜素/亞油酸實驗中,400μg·mL-1的Xylaria sp.YX-28甲醇粗提物具有72.9％的抑制活性,顯著高于陽性對照二丁基羥基甲苯(BHT)和抗壞血酸(Asc