人源抗發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒-Gn蛋白基因工程抗體的研究.pdf

1、發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(Severe fever with thrombocytopeniasyndrome virus，SFTSV)屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬，作為一種新發(fā)的病毒，人們對其感染過程以及引起的機體免疫反應了解較少，SFTSV感染后，患者主要表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、惡心、嘔吐等胃腸道癥狀。在少數(shù)情況下，會引起意識障礙、皮膚瘀斑、消化道出血、肺出血等嚴重癥狀，并造成休克、呼吸衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)等多功能臟器衰

2、竭，最終導致死亡。目前，還沒有用于臨床治療的藥物，所以本研究的目的主要是為了制備人源抗發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒-Gn蛋白的基因工程抗體，一方面可以用于病毒感染的臨床檢測，另外一方面也可以用于抗體藥物的制備。
　　本研究利用噬菌體表面展示技術篩選出具有特異性以及高親和性的單克隆抗體，該技術在目前科學研究，疾病診斷以及臨床抗體藥物的制備中都有成功的先例。所謂的噬菌體抗體庫技術就是將Fab或者scFv抗體基因與噬菌體外殼蛋白結構

3、基因相互耦聯(lián)，使抗體蛋白融合表達在噬菌體外殼蛋白的N端，抗體蛋白能夠自發(fā)的折疊而呈天然蛋白狀態(tài)，并且能夠保持相對獨立的空間結構和生物活性，有利于被靶分子識別以及與靶分子結合，通過“吸附-洗脫-擴增”三輪富集過程，可以從噬菌體抗體庫中篩選出特異性針對抗原的單克隆抗體，并且通過各種試驗對表達的抗體進行功能鑒定。
　　本研究主要分兩大部分:
　　第一部分:我們分別采用SFTSV-AH12全病毒顆粒和重組表達SFTSV-Gn蛋白對人

4、源抗SFTSV Fab噬菌體抗體庫進行富集篩選，分別經(jīng)過三輪的“吸附-洗脫-富集”過程，隨機各挑選了400個克隆，通過ELISA對Fab抗體的結合特異性進行檢測。結果顯示通過病毒顆粒篩選，我們獲得了364株特異性針對SFTSV核蛋白的陽性克隆，并沒有獲得特異性針對Gn蛋白的陽性克隆;經(jīng)過包被SFTSV-Gn重組蛋白篩選，我們獲得55株與Gn蛋白特異性結合的陽性克隆，經(jīng)序列分析，總共獲得8株唯一序列的陽性克隆，其中5株來自Lambda庫，

5、3株來自Kappa庫。
　　第二部分:將8株Fab抗體可變區(qū)基因克隆入單質(zhì)粒/哺乳動物細胞表達載體HL51-14上，通過PEI轉染試劑瞬時轉染293T細胞，收集細胞上清獲取分泌表達的IgG全抗體，并使用Protein-A親和層析柱純化IgG抗體，分別采用ELISA、IFA和Western-blotting方法對IgG全抗體進行功能鑒定，并通過微量中和試驗檢測IgG抗體的中和活性。結果表明經(jīng)ELISA、IFA和Western-blo

6、tting檢測證實這8株IgG抗體均能特異性結合Gn蛋白，且針對的是線性表位，微量中和試驗顯示8株新篩抗體沒有表現(xiàn)出中和活性。通過競爭ELISA試驗顯示8株IgG抗體與mAb-1C8作用于不同的抗原表位，mAb-1C8已經(jīng)證實具有中和活性，且結合的抗原表位是構象表位。
　　綜上所述，通過病毒顆粒篩選出大量針對NP的Fab抗體，并沒有篩選得到特異性針對Gn蛋白抗體，表明NP具有強的免疫原性，在SFTSV感染機體免疫中發(fā)揮重要作用;通