TLR4對大鼠腦出血后炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用研究.pdf

1、目的： 腦出血是神經(jīng)系統(tǒng)常見病、多發(fā)病，其致殘率和死亡率均很高，嚴(yán)重影響人類的健康和患者的生存質(zhì)量。近年來，炎癥反應(yīng)在腦出血后繼發(fā)性損傷中的作用越來越受到重視，并認(rèn)為它可能導(dǎo)致了腦出血后的細(xì)胞凋亡過程。目前腦出血后炎癥發(fā)生機(jī)制目前仍不十分清楚，其產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的始動(dòng)環(huán)節(jié)尚不明確。TLRs是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的有高度保守序列而古老的天然免疫受體家族。TLR4作為膜受體“門戶”蛋白能夠識別生物源性和非生物源性刺激，然后將信號傳遞給核轉(zhuǎn)錄因子N

2、F-кB，啟動(dòng)和放大炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致多種炎癥因子的瀑布式釋放，產(chǎn)生損傷效應(yīng)。本研究利用立體定向技術(shù)向大鼠尾狀核內(nèi)注入50μL自體股動(dòng)脈血建立腦出血模型，用TUNEL染色觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡，用免疫組化法檢測腦出血后的血腫周圍腦組織TLR4、NF-кB/p65和caspase-3的表達(dá)動(dòng)態(tài)變化，用RT-PCR法檢測血腫周圍腦組織TLR4mRNA表達(dá)，旨在研究TLR4mRNA及蛋白是否在腦出血后血腫周圍腦組織表達(dá)及分布，從而探討TLR4信號通路在

3、腦出血后繼發(fā)損傷(主要指凋亡)中的作用研究。 材料與方法 一、材料 1、動(dòng)物分組 選擇健康雄性Wister大鼠90只，體重250-300g，隨機(jī)分成個(gè)生理鹽水對照組、腦出血實(shí)驗(yàn)組，分別按6h、1d、3d、7d分為4個(gè)亞組，每個(gè)亞組n=10；1個(gè)正常對照組，n=10。 2、主要儀器 動(dòng)物頭顱立體定位儀、電子分析天平、圖像分析儀、紫外分光光度儀、PCR擴(kuò)增儀、低溫離心機(jī)、凝膠成像分析系統(tǒng)。

4、 3、主要試劑 TLR4兔抗鼠多克隆抗體、NF-кBp65兔抗鼠多克隆抗、Caspase-3兔抗鼠多克隆抗體、二部法免疫組化檢測試劑盒、即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB試劑盒、Trizol、RNAPCRKit(AMV)、TLR4、引物、DNAMaker、DEPC、氯仿、異丙醇4、大鼠腦出血模型制作用微量注射器抽取70uL大鼠自體股動(dòng)脈血。立即將大鼠俯臥位于腦立體定位儀上，于前囟前0.2mm，中線右旁3.0mm，進(jìn)針約6m

5、m(大鼠尾狀核處)，將大鼠自體股動(dòng)脈血50uL緩慢推注入腦。生理鹽水對照組注入50uL生理鹽水。正常對照組不予任何處置。 5、標(biāo)本制作 取各組5只大鼠于術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)麻醉開胸，迅速暴露心臟，4％多聚甲醛灌注固定，取腦，樣本置于4％多聚甲醛外固定4小時(shí)，酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。連續(xù)冠狀切片，片厚5um，進(jìn)行切片HE染色和免疫組化染色。取各組5只大鼠于術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)麻醉，斷頭取腦，置于Trizol中，-80℃冰箱保

6、存，待進(jìn)行RT-PCR檢測。 二、檢測指標(biāo) 1、TUNEL陽性細(xì)胞檢測切片滴加脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TDT)和地高辛標(biāo)記的dUTP反應(yīng)液，37℃孵育120min；滴加生物素化抗地高辛抗體，37℃孵育30min，各步驟用0.01MTBS(pH7.5)洗滌3min×3次；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。顯微圖像分析系統(tǒng)采集圖像，分析陽性細(xì)胞積分光密度。 2、TLR4蛋白表達(dá)免疫組化檢測二步法進(jìn)行TLR4蛋白表

7、達(dá)陽性細(xì)胞測定。切片滴加50uL兔抗鼠多克隆TLR4抗體(1:150)，4℃過夜，PBS洗3min×3次；滴加一滴山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體，各步驟用PBS洗3min×3次，DAB顯色劑，蘇木素輕度復(fù)染，脫水透明，封片。顯微圖像分析系統(tǒng)采集圖像，分析陽性細(xì)胞積分光密度。 3、NF-кB/p65蛋白、Caspase-3蛋白表達(dá)免疫組化檢測SABC法進(jìn)行NF-кB/p65蛋白、Caspase-3蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞測定。切片滴加5

8、0uL一抗工作液(兔抗鼠多克隆NF-кB/p65抗體(1:400)、兔抗鼠多克隆Caspase-3抗體(1:150))，4℃過夜；然后滴加物素化山羊抗兔IgG，37℃20min；滴加SABC，37℃20min，各步驟用PBS洗3min×3次；DAB顯色劑，木素輕度復(fù)染，脫水透明，封片。顯微圖像分析系統(tǒng)采集圖像，分析陽性細(xì)胞積分光密度。 4、TLR4mRNA表達(dá)RT-PCR方法檢測取腦出血血腫周圍腦組織100mg，按Trizol法

9、RNA提取試劑盒說明，在無RNA酶的環(huán)境下提取總RNA后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴(kuò)增反應(yīng)，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，泳結(jié)果用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，計(jì)算TLR4mRNA與βactinmRNA光密度積分比值。 三、統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS17.0及Excel統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間比較用單因素方差分析(ANOVA)，在單因素方差分析有意義的基礎(chǔ)上再進(jìn)行組間兩兩比較，兩變量之間相關(guān)關(guān)系行

10、peasron相關(guān)分析，p<0.05為差異顯著。 結(jié)果： 1、腦出血后細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化TUNEL染色陽性細(xì)胞在腦出血后6h出現(xiàn)，1d凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，3d達(dá)到高峰，7d后逐漸減少，但是與對照組相比仍有顯著差異(p<0.05)。凋亡細(xì)胞數(shù)主要在血腫周圍和同側(cè)大腦皮層。腦出血后3d出現(xiàn)一些典型凋亡細(xì)胞，如新月形、馬蹄形和由核碎片聚集的凋亡小體。凋亡細(xì)胞大部分是神經(jīng)元細(xì)胞。 2、腦出血后caspase-3蛋白表達(dá)腦

11、出血后6h在血腫周圍和同側(cè)大腦皮層有caspase-3弱陽性表達(dá)，陽性部位主要為胞漿。1d后出現(xiàn)大量陽性反應(yīng)神經(jīng)元。腦出血后3d達(dá)高峰，著色最深，呈棕褐色，并出現(xiàn)核陽性著色，說明caspase-3裂解后有核轉(zhuǎn)移。7d后數(shù)量減少，但積分光密度較對照組仍有顯著差異(P<0.05)。 3、腦出血后NF-кBp65表達(dá)腦出血后血腫周圍NF-кBp65陽性細(xì)胞于術(shù)后6h開始增多，1d其表達(dá)繼續(xù)上升，3d達(dá)高峰，此后NF-кBp65表達(dá)開始

12、下降，持續(xù)到7d仍高于對照組(p<0.05)。其表達(dá)以膠質(zhì)細(xì)胞為主，也有部分神經(jīng)元細(xì)胞，陽性表達(dá)為胞核黃褐色，蘇木素不能復(fù)染。血腫對側(cè)也有少量NF-кBp65表達(dá)。生理鹽水對照組僅有極少量陽性細(xì)胞。 4、腦組織TLR4蛋白表達(dá)腦出血組出血腫周圍和同側(cè)大腦皮層有TLR4表達(dá)均高于對照組，6h開始升高，3d達(dá)高峰，其分布更為普及和均一化，之后表達(dá)強(qiáng)度緩慢下降，7天后表達(dá)與對照組相比仍有顯著差異(p<0.05)。 5、腦組織T

13、LR4mRNA表達(dá)結(jié)果顯示正常大鼠腦組織有TLR4mRNA表達(dá)，生理鹽水對照組TLR4mRNA表達(dá)升高，與正常對照組及組間比較無顯著差異；腦出血組TLR4mRNA表達(dá)均高于對照組，6h開始升高，3d達(dá)高峰，7d后逐漸減低，但與對照組仍有顯著差異(p<0.05)。 討論 在本實(shí)驗(yàn)中采用向大鼠右側(cè)尾狀核內(nèi)注射自體股動(dòng)脈血制作腦出血模型，通過rt-PCR和免疫組化法對TLR4進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)出血后的大鼠腦組織中TLR4mRNA和

14、蛋白均動(dòng)態(tài)表達(dá)。近年來，許多實(shí)驗(yàn)研究都證實(shí)，細(xì)胞凋亡機(jī)制參與了腦出血后繼發(fā)性損傷。在本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用相鄰切片分別進(jìn)行Caspase-3免疫組化和TUNEL染色，兩者陽性細(xì)胞范圍及時(shí)間變化基本一致。提示Caspase-3在腦出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡中起重要調(diào)控作用。NF-кB信號通路是TLR4胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最重要的下游通路，參與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等重要的病理生理過程。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TL4表達(dá)與NF-кB表達(dá)量及核陽性率的升高呈正相關(guān)，且與炎癥細(xì)胞

15、浸潤高峰也一致，這表明TLR4表達(dá)的增多伴有神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NF-кB的激活，即NF-кB的核移位，但是這并不能從本質(zhì)上說明TLR4激活了NF-кB，只能說TL4參與了腦出血后大鼠腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)。但已有大量實(shí)驗(yàn)證明TLR4信號途徑主要集中激活NF-кB，啟動(dòng)和放大炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致多種炎癥因子的瀑布式釋放，產(chǎn)生損傷效應(yīng)。大量文獻(xiàn)也證實(shí)了腦出血后血腫周圍存在上述炎癥反應(yīng)，并認(rèn)為它可能導(dǎo)致了腦出血后的細(xì)胞凋亡過程。大鼠腦出血后炎癥細(xì)胞浸潤時(shí)間與細(xì)胞凋