腦出血后氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和c-myc表達(dá)的影響.pdf

1、腦血管疾病是臨床上常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)病率、致殘率、死亡率逐年增加，其中腦出血患者死亡率相對(duì)較高。老年人是腦出血的高危人群，主要危險(xiǎn)因素包括腦動(dòng)脈粥樣硬化、腦血管畸形和高血壓。目前腦出血后損傷機(jī)制尚未完全闡明，也沒(méi)有顯著改善患者預(yù)后的治療方法。腦出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷的一個(gè)重要因素，包括較為復(fù)雜的多種機(jī)制參與，其中有氧化應(yīng)激、炎癥和神經(jīng)細(xì)胞凋亡等。氧化應(yīng)激與出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。在缺氧條件下，活性氧(ROS)和NO

2、被激活，由于腦組織高氧化代謝率和較低的抗氧化水平，易受ROS誘導(dǎo)，啟動(dòng)線粒體凋亡途徑。腦出血后大量自由基的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)/功能異常，炎性介質(zhì)引起白細(xì)胞粘附和聚集，阻塞微血管，進(jìn)一步激活白細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，因此白細(xì)胞釋放ROS誘導(dǎo)缺血性級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞繼發(fā)性損傷。核因子(NF)-κ B是具有多種調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。腦出血后氧化應(yīng)激可以激活核因子(NF)-κ B，誘導(dǎo)大量的炎性趨化因子、炎性介導(dǎo)細(xì)胞因子如

3、IL-6、IL-8產(chǎn)生，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄水平，在細(xì)胞炎癥和凋亡中起重要作用。既往研究表明NF-κB參與腦出血的病理生理過(guò)程，其中小膠質(zhì)細(xì)胞被激活產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和神經(jīng)毒性分子，釋放大量的游離氧和細(xì)胞因子，激活NF-κB，并參與神經(jīng)損傷和修復(fù)、炎癥和氧化應(yīng)激。C-myc具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和凋亡的雙重作用:在氧化應(yīng)激下，ROS激活NF-κ B，啟動(dòng)凋亡相關(guān)基因c-myc與Max形成二聚體，進(jìn)一步結(jié)合到DNA核心序列上以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。因此，本研究建

4、立了大鼠腦出血模型，觀察了腦出血后氧化應(yīng)激和神經(jīng)細(xì)胞凋亡之間的相關(guān)性，以及凋亡相關(guān)基因c-myc的表達(dá)效應(yīng)。
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組
　　健康雄性SD大鼠（7周齡，體重220～240g）由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（證書(shū)編號(hào)SYXK-2013-0025），并飼養(yǎng)在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中，提供自由采食的食物和水。將雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組和MPEG-SOD組（每組N=28）。采取自體血液輸注的方法建立大鼠腦出血模型，M

5、PEG-SOD組大鼠腹腔注射MPEG-SOD。假手術(shù)組和模型組中的大鼠接受等體積的鹽水。入組大鼠用于所有實(shí)驗(yàn)，所有程序均經(jīng)山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
　　2.藥物和試劑
　　丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)購(gòu)自建成生物（中國(guó)）。水合氯醛和多聚甲醛購(gòu)自Kemiou Chem（中國(guó)）。兔抗NF-κB抗體購(gòu)自Boster Bio（中國(guó)）。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自CST(US)。C

6、-myc抗體購(gòu)自Santa Cruz(US)。DAB染色試劑盒購(gòu)自金橋（中國(guó)）。TUNEL測(cè)試試劑盒購(gòu)自Roche(US)。
　　3.動(dòng)物模型
　　術(shù)前1h測(cè)量神經(jīng)功能缺損評(píng)分(NDS)，以排除那些具有原發(fā)性神經(jīng)功能缺損的大鼠。腦出血模型是通過(guò)自體血液輸血產(chǎn)生的，如前所述[13]。簡(jiǎn)言之，在手術(shù)前8小時(shí)禁食大鼠。在10％水合氯醛中麻醉后，將大鼠仰臥位固定，用腦立體定向儀固定大鼠頭部。參考大鼠腦圖譜定位尾狀核，使用微加載針將從

7、大鼠尾部靜脈血管收集的50μL動(dòng)脈血（以25 u L/min速度）輸注到尾狀核。持續(xù)10分鐘，針緩慢縮回，用骨蠟密封鉆孔。切口無(wú)菌縫合。假手術(shù)組用同樣方法在大鼠相同位置施加等體積的鹽水。
　　4.給藥
　　MPEG-SOD組在模型制備前20分鐘通過(guò)腹腔內(nèi)注射MPEG-SOD(100U)。假手術(shù)組和模型組給予等體積的鹽水。
　　5.動(dòng)物恢復(fù)及神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估(NDS)
　　采用Longa的5級(jí)評(píng)分法對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損

8、進(jìn)行評(píng)價(jià)。大鼠從麻醉中清醒后，Longa評(píng)分Ⅱ級(jí)及以上為成功建立大鼠腦出血模型。術(shù)后12h、1d、3d和7d，采用Garcia評(píng)分法重新評(píng)估NDS，范圍為3分～18分。
　　6.MDA和SOD水平測(cè)定和腦組織中的水含量定量
　　手術(shù)后12h、1d、3d和7d處死大鼠，從出血側(cè)提取腦組織(N=7)。在4℃的預(yù)冷鹽水中洗滌大鼠腦組織，并在除去表面水后稱重。制備10％皮質(zhì)勻漿，離心10分鐘，收集上清液。蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)比色

9、法定量，MDA測(cè)定采用硫代巴比妥比色法， SOD測(cè)定采用測(cè)定黃嘌呤氧化法，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行各項(xiàng)操作內(nèi)容，試劑盒采購(gòu)于南京建成生物工程研究所。從血腫穿刺部位的后側(cè)和前側(cè)收集組織樣品(1mm3)，用于計(jì)算水含量，其定義為（濕重-干重）/濕重×100％。
　　7.HE染色
　　大鼠用4％多聚甲醛固定，并斷頭取腦。小腦、嗅球和低位腦干都被切除，剩余的腦組織浸沒(méi)在多聚甲醛中。于前囟后1.4mm行冠狀切片。在光場(chǎng)顯微鏡下蘇木精-

10、伊紅染色觀察。
　　8.免疫組織化學(xué)(IHC)染色NF-κ Bp65蛋白表達(dá)
　　在所有時(shí)間點(diǎn)處死大鼠并提取已切除小腦和嗅球的腦，隨后浸沒(méi)在多聚甲醛中。制備石蠟切片(8 u m)。脫蠟后，將組織切片在PBS pH7.4中漂洗三次（每次3分鐘），進(jìn)行抗原修復(fù)，接著用3％ H2 O2孵育10分鐘以阻斷過(guò)氧化物酶的內(nèi)源性活性。加入一抗（1∶1000稀釋）1小時(shí)室溫孵育，然后加入聚合物增強(qiáng)劑（20分鐘室溫孵育）。加入酶標(biāo)記的抗小鼠/

11、兔聚合物，室溫孵育30分鐘。在顯微鏡觀察下加入新鮮制備的DAB緩沖液5分鐘。蘇木精用于復(fù)染和0.1％HCl分化。使用自來(lái)水沖洗載玻片，然后在梯度乙醇中脫水。加入二甲苯，隨后進(jìn)行樹(shù)脂安裝。使用Image-pro plus系統(tǒng)(Media Cybernetics，IPP成像分析軟件corp，US)分析在光場(chǎng)顯微鏡下觀察到的結(jié)果。在40X放大倍數(shù)下在血腫周圍選擇五個(gè)不同的視野，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)的平均值。
　　9.Western印跡檢測(cè)

12、c-myc蛋白在腦組織中的表達(dá)
　　將血腫周圍的大鼠腦組織在裂解緩沖液中裂解并通過(guò)離心收集溶液。應(yīng)用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。通過(guò)SDS-PAGE電泳（8μL上樣，75V25分鐘，隨后用110V電泳直到溴酚藍(lán)到達(dá)分離凝膠底部）分離蛋白質(zhì)樣品，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜（110V45分鐘）。將膜在封閉緩沖液中封閉1小時(shí)，隨后在4℃下孵育過(guò)夜并TBST洗滌的第一抗體（1∶100的抗c-myc或1∶1000的抗β-肌動(dòng)蛋白）孵育過(guò)夜。加入二抗

13、(1∶2000)1小時(shí)孵育。在TBST沖洗三次后，加入顯影試劑在黑暗中曝光。使用Quantity One圖像分析軟件(BioRad，US)分析彩色條帶，其相對(duì)表達(dá)式確定為目標(biāo)蛋白質(zhì)條帶對(duì)內(nèi)部參照蛋白質(zhì)的吸光度值的比率。
　　10.TUNEL測(cè)定神經(jīng)組織凋亡
　　石蠟切片脫蠟并再水化。加入蛋白酶K在室溫下孵育，然后用H2 O2-甲醇封閉。將組織載玻片在PBS中漂洗兩次，并在中性緩沖液（室溫下1小時(shí)）中漂洗。使用過(guò)氧化氫酶室溫孵

14、育30分鐘，隨后進(jìn)行DAB顯色和甲基綠對(duì)比染色。將組織切片脫水，并在光學(xué)顯微鏡下觀察。使用Image-pro plus系統(tǒng)(MediaCybernetics，IPP成像分析軟件corp，US)分析在光學(xué)顯微鏡（10個(gè)隨機(jī)選擇的視野，400X放大率）下觀察到的陽(yáng)性細(xì)胞的總數(shù)。
　　11.統(tǒng)計(jì)方法
　　使用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。首先測(cè)試數(shù)據(jù)的正態(tài)性分布，符合正態(tài)分布用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)

15、行多組間比較，兩兩比較應(yīng)用LSD方法。p＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異。
　　結(jié)果:
　　1.NDS評(píng)分
　　假手術(shù)組中沒(méi)有觀察到大鼠肢體麻痹，并對(duì)肢體末端的疼痛刺激反應(yīng)靈敏，因此NDS評(píng)分0級(jí)。模型組和治療組大鼠均有腦血腫對(duì)側(cè)肢體麻痹，行走呈“追尾”步態(tài)，兩組大鼠提取的腦組織均可見(jiàn)到明顯的圓形血腫。4例死于圍手術(shù)期感染或蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠及4例術(shù)后NDS評(píng)分0級(jí)大鼠均從測(cè)試隊(duì)列中剔除。腦出血的評(píng)估見(jiàn)圖1。
　　假

16、手術(shù)組中大鼠沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的行為改變。模型組大鼠神經(jīng)功能缺陷明顯，且術(shù)后3d NDS評(píng)分最高。與模型組相比，MPEG-SOD組大鼠在術(shù)后12h、1d、3d和7d的NDS評(píng)分均差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05，圖2）。
　　2.手術(shù)后腦組織水腫
　　假手術(shù)組大鼠腦組織沒(méi)有觀察到明顯的水腫。模型組大鼠術(shù)后有腦水腫，術(shù)后3d達(dá)峰值并逐漸減輕。MPEG-SOD組與模型組相比，所有時(shí)間點(diǎn)腦水腫均明顯減輕（p＜0.05，圖3）。

17、>　　3.大鼠腦組織形態(tài)
　　HE染色和光學(xué)顯微鏡觀察，假手術(shù)組大鼠腦組織沒(méi)有觀察到明顯變化，腦組織排列規(guī)整、形態(tài)完整，細(xì)胞數(shù)量和結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠在所有時(shí)間點(diǎn)均觀察到腦組織不規(guī)則的神經(jīng)細(xì)胞排列，不同程度的神經(jīng)細(xì)胞腫脹，并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膠質(zhì)增生，最嚴(yán)重的病理?yè)p傷發(fā)生在術(shù)后3d。與模型組相比，MPEG-SOD組大鼠腦組織損傷在所有時(shí)間點(diǎn)均明顯減輕（圖4）。
　　4.腦組織的MDA和SOD水平
　　與假手術(shù)組相比，模

18、型組大鼠在術(shù)后的所有時(shí)間點(diǎn)MDA水平均顯著升高及SOD水平均顯著降低(p＜0.05)。與模型組相比，MPEG-SOD組大鼠MDA水平顯著降低和SOD水平顯著升高（p＜0.05，圖5）。
　　5.NF-κ Bp65蛋白表達(dá)檢測(cè)
　　NF-κ Bp65蛋白的陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，如棕色顆粒所示。假手術(shù)組大鼠腦組織中NF-κ Bp65的陽(yáng)性表達(dá)較少。而模型組大鼠在術(shù)后12h NF-κ Bp65陽(yáng)性表達(dá)升高，3d達(dá)峰值，NF

19、-κ Bp65陽(yáng)性表達(dá)持續(xù)至術(shù)后7d。與模型組相比，MEPG-SOD組NF-κ Bp65陽(yáng)性表達(dá)在所有時(shí)間點(diǎn)均明顯降低（圖6）。
　　6.TUNEL神經(jīng)細(xì)胞凋亡
　　大多數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞位于神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)部，如棕黃色所示。與假手術(shù)組相比，模型組TUNEL陽(yáng)性比率相對(duì)較高，在術(shù)后3d達(dá)到峰值，然后逐漸減少。MPEG-SOD組與模型組相比在所有時(shí)間點(diǎn)TUNEL陽(yáng)性比率均顯著降低（圖7和圖8）。
　　7.Western印跡

20、檢測(cè)c-myc蛋白在腦組織中的表達(dá)
　　在術(shù)后的所有時(shí)間點(diǎn)，模型組大鼠腦組織中的c-myc蛋白表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(p＜0.05)，模型組大鼠在術(shù)后3d腦組織c-myc蛋白表達(dá)達(dá)峰值，而MPEG-SOD組在所有時(shí)間點(diǎn)與模型組相比均具有較低的c-myc蛋白表達(dá)(p＜0.05，圖9和圖10)。
　　結(jié)論:
　　1、腦出血后腦組織氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA水平升高，SOD水平降低，提示腦出血后氧化應(yīng)激狀態(tài)明顯。
　　2、腦

21、出血后腦組織NF-κ Bp65蛋白術(shù)后12h表達(dá)增加，3d達(dá)峰值，術(shù)后7d，NF-κ Bp65陽(yáng)性表達(dá)仍然可見(jiàn)。提示出血后氧化應(yīng)激誘導(dǎo)NF-κB的活化，且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，可能是繼發(fā)性腦損傷的重要環(huán)節(jié)。c-myc蛋白的表達(dá)與TUNEL-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)一致，術(shù)后3d達(dá)到峰值，然后逐漸減少。提示腦出血后氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能與NF-κB的活化和凋亡相關(guān)基因c-myc的啟動(dòng)相關(guān)。
　　3、抗氧化物MPEG-SOD可抑制腦出血后氧化應(yīng)激狀態(tài)