凝血酶和凝血因子Xa在Meg-01細胞分化為血小板中的作用及其機制.pdf

1、凝血酶和凝血因子Xa(FXa)是凝血系統(tǒng)中重要的兩個凝血因子，本研究分別探討凝血酶和凝血因子Xa對Meg-01細胞分化為血小板的作用機制。
　　凝血酶是一種有絲分裂原，可以誘導多種細胞功能。我們先以凝血酶為激動劑，研究了凝血酶在Meg-01細胞分化為血小板樣顆粒中的作用及其機制。使用TPO作為陽性對照，采用CCK-8法檢測Meg-01細胞增殖活性;采用AlamaBlue試劑盒分析血小板樣顆粒活性;通過熒光定量PCR檢測GATA-1

2、、Bcl-2、PAR1和PAR4的mRNA水平的表達;通過Western blot檢測MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路及PTEN表達水平;巨核細胞分化標志蛋白CD41b的表達采用Western blot和流式細胞術兩種方法檢測;巨核細胞和血小板標志性糖蛋白CD61的表達、細胞周期變化和細胞凋亡情況采用流式細胞術進行檢測;以ADP作為激活劑，在顯微鏡下觀察血小板樣顆粒的聚集狀態(tài)。結果表明:Meg-01細胞的CD61陽性率高達92

3、.4％。凝血酶刺激后Meg-01細胞產生了偽足和血小板樣顆粒物。凝血酶可抑制Meg-01細胞的增殖，促進其凋亡，誘導細胞周期阻滯在G0/G1期。凝血酶上調了控制巨核細胞發(fā)育成熟的細胞轉錄因子GATA-1、凝血酶受體PAR1和PAR4的mRNA表達，下調了凋亡抑制蛋白Bcl-2的mRNA水平。凝血酶促進CD41b表達升高，下調PTEN的表達并上調ERK和AKT磷酸化水平。經凝血酶誘導產生的血小板樣顆粒具有活性，并能發(fā)生聚集反應。由此可見，

4、凝血酶可能在巨核細胞分化為血小板的過程中發(fā)揮一定的作用。
　　FXa和凝血酶同樣是凝血系統(tǒng)中關鍵的凝血因子，F(xiàn)xa是一種絲氨酸蛋白酶，既然凝血酶可能在巨核細胞分化為血小板的過程中發(fā)揮一定的作用，且這種作用可能是通過PARs進行，那么Fxa可能也通過激活PARs對巨核細胞分化產生一定影響。因此，接著探討了Fxa在成巨核細胞白血病細胞Meg-01細胞分化為血小板樣顆粒中的作用及其機制。采用CCK-8法檢測Meg-01細胞增殖活性;采用

5、AlamaBlue試劑盒分析血小板樣顆?；钚?通過流式細胞術檢測細胞周期變化和細胞凋亡情況;周期相關蛋白Skp2的表達和MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路通過Western blot檢測;巨核細胞分化標志蛋白CD41b表達采用Western blot和流式細胞術檢測。結果表明:Fxa也能促進巨核細胞產生偽足和血小板樣顆粒。FXa抑制Meg-01細胞的增殖，促進其凋亡，還可以觸發(fā)細胞G2/M期阻滯并下調Skp2蛋白表達。Fxa促進