先天性進(jìn)行性皮質(zhì)點(diǎn)狀白內(nèi)障相關(guān)候選基因定位及功能研究.pdf

1、研究背景：
　　白內(nèi)障是目前我國(guó)乃至世界首位的致盲原因。其中，先天性白內(nèi)障已成為兒童失明和視力障礙的主要原因，國(guó)外報(bào)道其發(fā)病率為(1-6)/萬，居兒童失明原因的第二位。先天性白內(nèi)障的發(fā)病原因眾多，機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為約1/3與遺傳因素有關(guān)。因此，疾病相關(guān)候選基因和突變方式的研究成為遺傳性白內(nèi)障的研究熱點(diǎn)。迄今為止，已經(jīng)鑒定和克隆的與遺傳性白內(nèi)障有關(guān)的致病基因至少有26個(gè)，相關(guān)的突變型更是多達(dá)40余種。然而，遺傳性白內(nèi)障具有明顯的遺傳

2、異質(zhì)性（即同一基因型可具有不同的臨床表型，而同一臨床表現(xiàn)也可由不同的基因型決定），其形態(tài)不一的臨床表型無疑為致病基因的鑒定增加了困難。同時(shí)，隨著人類基因組計(jì)劃的完成，各項(xiàng)研究特別是遺傳性疾病的研究將逐漸迎來“后基因組時(shí)代”，即對(duì)致病基因的功能以及突變蛋白具體致病機(jī)制的研究。因此，遺傳性白內(nèi)障致病基因的鑒定和功能研究，不僅將進(jìn)一步豐富目前已知的疾病相關(guān)基因庫，為開展遺傳性白內(nèi)障的產(chǎn)前診斷和基因診斷作出貢獻(xiàn)，而且有助于揭示晶狀體混濁的發(fā)病機(jī)

3、制，為理解白內(nèi)障的致病機(jī)制和后續(xù)相關(guān)的基因治療奠定基礎(chǔ)。本文就我們收集的我國(guó)浙江省地區(qū)一個(gè)先天性進(jìn)行性皮質(zhì)點(diǎn)狀白內(nèi)障家系進(jìn)行致病基因定位和突變蛋白功能研究。
　　研究方法：
　　對(duì)參與本次研究的家系成員進(jìn)行詳細(xì)的家族史及臨床資料的采集，并對(duì)所有的家系成員進(jìn)行全面的眼科檢查，包括視力、裂隙燈、散瞳眼底檢查等。根據(jù)系譜行遺傳方式分析，初步確定家系的遺傳方式。提取家系成員外周血樣本并抽提基因組DNA，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增

4、疾病相關(guān)的候選基因的所有外顯子及內(nèi)含子外顯子交界區(qū)，利用直接測(cè)序法確定致病的突變基因及位點(diǎn)，借助生物信息學(xué)方法(Polyphen-2 and SIFT)對(duì)突變基因的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析。以正常人晶狀體cDNA文庫為模板，通過PCR反應(yīng)獲得野生型目的基因的cDNA序列，利用DNA重組技術(shù)克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1-，利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建攜帶突變基因的質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染至人宮頸癌上皮細(xì)胞(HeLa)，免疫熒光技術(shù)檢測(cè)HeLa細(xì)胞中AQP0

5、的表達(dá)并采用激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白定位。
　　結(jié)果：
　　1、臨床檢查表明此遺傳性白內(nèi)障家系的表型為皮質(zhì)點(diǎn)狀混濁，呈進(jìn)行性，遺傳方式為常染色體顯性遺傳。針對(duì)家系候選基因進(jìn)行突變篩查，對(duì)CRYAA、CRYBA1、CRYGD、CRYGS、MIP、GJA3六個(gè)候選基因進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在MIP基因第2號(hào)外顯子第88個(gè)堿基發(fā)生了G→C的置換(c.448 G＞C)，該突變使得MIP編碼的AQP0蛋白的第150個(gè)氨基酸（位于Loop D區(qū)

6、段）發(fā)生天冬氨酸到組氨酸的轉(zhuǎn)變(p.D150H)，家系中參與研究的正常人及200名正常對(duì)照組成員均未檢測(cè)到此突變存在，PolyPhen-2和SIFT分?jǐn)?shù)均提示D150H為影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的有意義的突變。
　　2、分別成功構(gòu)建表達(dá)野生型AQP0蛋白的質(zhì)粒pcDNA3.1-wtAQP0及表達(dá)突變蛋白的pcDNA3.1-AQP0D150H，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)突變蛋白在細(xì)胞內(nèi)聚集較多，細(xì)胞膜上定位較野生組明顯減少，提