先天性遺傳性白內(nèi)障家系突變基因定位及功能研究.pdf

1、背景:
　　先天性白內(nèi)障(congenital cataract)是一種較常見的兒童眼病，指出生前后即存在或出生后才逐漸形成的先天遺傳或發(fā)育障礙的白內(nèi)障，是造成兒童失明和弱視形成的重要原因。新生兒中先天性白內(nèi)障的發(fā)病率約為0.01％～0.06%，是導(dǎo)致兒童致盲的主要眼病之一。先天性白內(nèi)障可為家族性，也可為散發(fā)的；可單眼或雙眼發(fā)病，也可伴發(fā)眼部或全身的先天性異常。按其致病原因可分為與遺傳因素、環(huán)境因素相關(guān)以及原因不明三大類。經(jīng)過近些

2、年的研究，發(fā)現(xiàn)大約有1/3的先天性白內(nèi)障病例是與遺傳性因素相關(guān)的，其中以常染色體顯性遺傳為主。在我國，常染色體顯性遺傳占據(jù)總遺傳性先天性白內(nèi)障病例近73%，常染色體隱性遺傳占據(jù)近27%，目前尚未發(fā)現(xiàn)與性染色體遺傳因素相關(guān)的病例。
　　先天性白內(nèi)障的遺傳學(xué)研究已有上百年歷史。近年來，人類基因組計劃的完成極大地提高了遺傳性疾病相關(guān)致病基因的研究，迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)百余種與先天性白內(nèi)障相關(guān)的基因突變位點，主要集中在晶狀體蛋白基因中。目前

3、研究發(fā)現(xiàn)大約60%的遺傳性眼病的分子機(jī)制復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步深入的研究。
　　由于遺傳性先天性白內(nèi)障具有表型異質(zhì)性和遺傳異質(zhì)性，因此基因型和臨床表型之間的關(guān)系尚不明確。因此通過全面的分析遺傳性白內(nèi)障致病基因位點，研究該致病基因突變位點的功能，闡明其相關(guān)眼病的發(fā)病機(jī)理及其后期分子機(jī)制具有重要意義，為未來相關(guān)致病基因的功能研究及產(chǎn)前基因診療提供堅實的基礎(chǔ)。
　　第一部分：先天性白內(nèi)障家系分析
　　目的：

4、>　　了解先天性白內(nèi)障家系的發(fā)病情況，繪制系譜圖進(jìn)行系譜分析。
　　方法：
　　收集五個先天性白內(nèi)障家系，通過調(diào)查家系各個成員的病史、眼科檢查情況，根據(jù)各家族成員之間的親緣關(guān)系，明確患者白內(nèi)障的類型并繪制系譜圖，判斷相應(yīng)的遺傳方式。
　　結(jié)果：
　　通過調(diào)查臨床資料發(fā)現(xiàn)每個家系的患者之間晶狀體渾濁的形態(tài)和程度有所差異。通過對Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ這4個家系進(jìn)行家系分析可以看出患者在各代呈連續(xù)傳遞，符合常染色體顯性遺傳的特

5、點。家系 V只有一個患者，其父母表型正常，為散發(fā)病例。
　　結(jié)論：
　　家系內(nèi)的白內(nèi)障患者之間存在臨床異質(zhì)性。Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ這4個家系呈常染色體顯性遺傳。家系V只有一個患者，為散發(fā)病例。
　　第二部分：先天性白內(nèi)障疾病相關(guān)候選基因篩選及其生物信息學(xué)分析
　　目的：
　　篩選五個先天性白內(nèi)障家系相關(guān)致病基因的突變情況及其生物信息分析。
　　方法：
　　收集五個家系血樣及100名健康人血樣，用二代測

6、序技術(shù)對各個家系患者疾病相關(guān)基因的突變情況進(jìn)行篩查，并且結(jié)合sanger測序?qū)梢晌稽c進(jìn)行驗證。通過SWISS-MODEL，SIFT，PolyPhen2，Protscale等在線預(yù)測工具對突變基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用光鏡和電鏡對患者晶狀體上皮細(xì)胞的大體形態(tài)結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。
　　結(jié)果：
　　通過DNA測序發(fā)現(xiàn)家系I中存在CRYBB2的c.436G>C雜合突變，該突變位點未在家系其他健康成員和健康對照組中發(fā)現(xiàn)，同樣發(fā)

7、現(xiàn) EPHA2基因的c.1532C>T雜合變異，但在家系健康成員中發(fā)現(xiàn)該突變位點。家系Ⅱ中存在CRYAA基因的c.344_352del雜合突變，該突變位點未在家系其他健康成員和健康對照組中發(fā)現(xiàn)，也檢測到EPHA2基因的c.1532C>T雜合變異，但在家系健康成員中發(fā)現(xiàn)該突變位點。家系Ⅲ中存在PAX6基因的c.718C>T雜合突變，該突變位點已經(jīng)在其他文獻(xiàn)中報道過。家系IV中存在GJA8基因的c.624C>G雜合變異，但在家系健康成員中發(fā)

8、現(xiàn)該突變位點，也檢測到WFS1基因的c.2576G>A雜合變異，該突變位點已經(jīng)在其他文獻(xiàn)中報道過。家系Ⅴ中存在 MAF基因的c.177dupC突變，該突變位點未在家系其他健康成員和健康對照組中發(fā)現(xiàn)。
　　經(jīng)查閱相關(guān)數(shù)據(jù)庫PAX6基因的c.718C>T雜合突變已有相關(guān)致病性報道，暫未發(fā)現(xiàn)CRYBB2的c.436G>C雜合突變、CRYAA基因的c.344_352del雜合突變、MAF基因的c.177dupC突變相關(guān)致病性報道。

9、　　對CRYBB2進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該突變位點會影響蛋白疏水性，對蛋白結(jié)構(gòu)和功能造成影響，可能是有意義的突變；同樣CRYAA和MAF也發(fā)現(xiàn)為有意義的突變。
　　對家系I的患者晶狀體上皮細(xì)胞鏡檢后未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有任何異?，F(xiàn)象出現(xiàn)。
　　結(jié)論：
　　CRYBB2的c.436G>C雜合突變、CRYAA基因的c.344_352del雜合突變、PAX6基因的c.718C>T雜合突變、MAF基因的c.177dupC突變分別為家系Ⅰ

10、、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ家系的致病突變，且CRYBB2 c.436G>C雜合突變、CRYAA c.344_352del雜合突變、MAF c.177dupC為新發(fā)突變。本研究未發(fā)現(xiàn)IV家系相關(guān)致病突變。
　　第三部分：CRYBB2基因野生型和突變型表達(dá)載體的構(gòu)建與CRYBB2基因突變的意義研究
　　目的：
　　了解CRYBB2的突變位點對βB2-晶狀體蛋白的影響。
　　方法：
　　根據(jù)體外 DNA重組技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒 EGF

11、P-CRYBB2-V146L和 EGFP-CRYBB2-WT。將構(gòu)建后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞中，通過qPCR和Western Blot驗證質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞后，利用熒光顯微鏡觀察突變型 CRYBB2和野生型CRYBB2在晶狀體上皮細(xì)胞中的分布情況。
　　結(jié)果：
　　經(jīng)過同源重組技術(shù)將野生型CRYBB2基因成功連接至pEGFP-N1上，通過點突變構(gòu)建出攜帶有突變型CRYBB2基因的質(zhì)粒。利用Lipofectamine2000將質(zhì)

12、粒成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，qPCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞中eGFP的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照細(xì)胞。Western Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的eGFP+CRYBB2融合蛋白成功表達(dá)。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)正常型βB2-晶狀體蛋白表達(dá)分布在整個細(xì)胞中，而突變型蛋白熒光聚集在人晶狀體上皮細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)分布在細(xì)胞核，而且呈現(xiàn)不均勻分布現(xiàn)象，存在某些部位高表達(dá)，某些部位低表達(dá)現(xiàn)象。
　　結(jié)論：
　　本部分研究成功構(gòu)建CRYBB2基因野生型和突變型表達(dá)載體