偽狂犬病毒pUL37、VP16、VP22單抗制備及免疫電鏡方法的建立.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的可感染多種哺乳動物的急性傳染病。豬是PRV的自然宿主，感染可造成懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，新生仔豬急性死亡。PRV屬于皰疹病毒科，具有皰疹病毒粒子的典型結(jié)構(gòu)，其中，被膜層是一個復雜的蛋白網(wǎng)絡，位于衣殼和囊膜之間。由UL37、UL48、UL49基因分別編碼的被膜蛋白pUL37、VP16、VP22在病毒復制及裝配中執(zhí)行著不

2、同的生物學功能，研究這些蛋白的功能對新的抗病毒靶點篩選具有重要意義。然而，對這些蛋白進行檢測和定位的方法還沒有建立起來。
　　本研究，首先將UL49、UL48、UL37基因分別克隆到真核表達載體pCAGGS，并采用KCl染色切膠法純化原核表達的蛋白。分別用真核質(zhì)粒和純化的蛋白作為抗原，對Balb/c小鼠進行3次免疫。通過細胞融合及單抗特性鑒定試驗獲得1株穩(wěn)定分泌VP22蛋白單抗的雜交瘤細胞株3D6;2株穩(wěn)定分泌VP16蛋白單抗的雜

3、交瘤細胞株1D4、4B6;3株穩(wěn)定分泌pUL37蛋白單抗的雜交瘤細胞株1E2、2G2、11C3。間接免疫熒光(ⅢA)和Western-blot試驗表明，抗體株均可與相應蛋白特異性結(jié)合;經(jīng)抗體亞類試劑盒鑒定，單抗亞類均為IgMκ;ELISA檢測單抗的效價，1D4為1∶8000，11C3為1∶6000，3D6為1∶3000，4B6為1∶4000，1E2、2G2為1∶32000。
　　測定PRV分離株HLJ-2013的病毒滴度，并將其(

4、0.1MOI)接種于易感性細胞PK15，16h后收集細胞并制備免疫標記用超薄切片。將以上實驗獲得的單克隆抗體進行1∶50，1∶100，1∶200稀釋作為一抗，商品化抗鼠金標抗體1∶100倍稀釋作為二抗，進行感染細胞內(nèi)偽狂犬病毒VP22、VP16、pUL37蛋白免疫標記和電鏡檢測。通過對免疫電鏡結(jié)果的分析，篩選出在亞細胞水平結(jié)合特異性強的單克隆抗體株:3D6、1D4、1E2，其最佳稀釋比例分別為:1∶100、1∶100、1∶200。