地塞米松和干擾素上調(diào)SARI表達(dá)的分子機(jī)制及其在抗淋巴瘤細(xì)胞增殖中的作用.pdf

1、研究背景:
　　地塞米松(Dexamethasone,Dex)因?qū)ρ合到y(tǒng)腫瘤(包括淋巴瘤)具有抗增殖、促凋亡、減輕化療副反應(yīng)的作用而被廣泛應(yīng)用于臨床,但其作用機(jī)制至今仍未完全明了。干擾素(interferon,IFN)是一類具有多效性的細(xì)胞因子,在淋巴瘤治療過程中效果顯著,抗瘤機(jī)制尚不清楚。目前已知Dex與糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid Receptors,GR)結(jié)合后才能發(fā)揮抗瘤效應(yīng)、STAT是IFN的下游靶基因

2、,而生物信息學(xué)分析提示干擾素誘導(dǎo)的活化蛋白-1抑制劑(suppressor of AP-1 regulated by interferon,SARI)啟動子區(qū)有GR、STAT的結(jié)合位點(diǎn)。SARI是新近發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因,于正常細(xì)胞中高表達(dá),而在相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)。因其可以特異性地抑制腫瘤細(xì)胞增殖,卻不殺傷正常細(xì)胞,故而在腫瘤生物治療領(lǐng)域有著誘人的前景。但是SARI抗腫瘤的分子機(jī)制仍未闡明,尤其是能調(diào)控SARI的上游分子仍未見

3、報道。
　　研究目的:
　　探討地塞米松和干擾素的抗淋巴瘤效應(yīng)對SARI基因表達(dá)的調(diào)控及其分子機(jī)制。
　　研究方法:
　　(1)用不同濃度的GR激動劑Dex單獨(dú)處理或者與GR拮抗劑米非司酮(Mifepristone,Mfp)聯(lián)合處理淋巴瘤細(xì)胞(Namalwa、JeKo-1)和單核細(xì)胞(THP-1)。CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況;RT-PCR、Realtime-PCR、Western blot分別從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水

4、平檢測SARI的表達(dá)情況。
　　(2)生物信息學(xué)分析SARI基因5’調(diào)控區(qū),預(yù)測GR結(jié)合位點(diǎn);分子克隆構(gòu)建SARI啟動子區(qū)截短的重組質(zhì)粒,Dex單獨(dú)或聯(lián)合Mfp處理轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的細(xì)胞,熒光素酶報告基因分析SARI基因啟動子活性;EMSA、ChIP分別從胞外和胞內(nèi)檢測GR與SARI啟動子區(qū)的特定序列能否直接結(jié)合;定向點(diǎn)突變該結(jié)合序列后再檢測SARI啟動子區(qū)活性。
　　(3)尾靜脈注射法和皮下注射法制備兩組荷瘤裸鼠模型,每組分

5、別給予PBS和Dex。記錄小鼠發(fā)生后肢癱瘓或死亡的天數(shù),取腫瘤組織稱重、測量并計算體積。取外周血液的淋巴細(xì)胞和腫瘤組織分別提取總RNA和總蛋白,RT-PCR、Realtime-PCR和Western Blot法檢測SARImRNA和蛋白變化。取腫瘤組織切片免疫組化法檢測SARI蛋白變化。
　　(4)siRNA抑制SARI表達(dá),CCK-8法檢測Dex對淋巴瘤細(xì)胞增殖的抑制情況,EMSA檢測SARI靶基因AP-1的活性,Realtim

6、ePCR、Westernblot檢測AP-1下游靶基因p53/p21mRNA和蛋白的變化。
　　(5)IFN-α/β分別處理淋巴瘤細(xì)胞(Namalwa、JeKo-1)和白血病細(xì)胞(Jurkat、THP-1)24h,CCK-8法檢測IFN-α/β對上述細(xì)胞的增殖抑制效果;RT-PCR、Realtime-PCR、Western blot檢測SARImRNA和蛋白水平的變化;對SARI基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測。<

7、br>　　研究結(jié)果:
　　(1)Dex呈劑量依賴性地抑制淋巴瘤細(xì)胞增殖,并能上調(diào)SARImRNA和蛋白的表達(dá),這一現(xiàn)象可以被Mfp逆轉(zhuǎn)。但是,二者對THP-1對照細(xì)胞的增殖及SARI表達(dá)均無明顯影響。(2)GR能顯著上調(diào)SARI基因啟動子活性,這也能被Mfp所抑制。(3)GR能與SARI基因啟動子區(qū)的順式作用元件ER9(-178TGTCCTccctcccctAGAACA-158)直接結(jié)合。(4)荷瘤裸鼠腹腔注射地塞米松能顯著抑制N

8、amalwa淋巴瘤增殖、延長裸鼠生存時間,同時上調(diào)外周血液淋巴細(xì)胞和腫瘤組織中SARImRNA和蛋白的表達(dá);免疫組化也證實了給藥組的腫瘤組織中SARI表達(dá)比對照組高。(5)siRNA抑制SARI表達(dá)后,Dex對淋巴瘤增殖的抑制能力、對AP-1活性及其靶基因p53/p21mRNA和蛋白表達(dá)的影響均被逆轉(zhuǎn)。(6)IFN-α和IFN-β均能有效殺傷淋巴瘤細(xì)胞(Namalwa、JeKo-1)并誘導(dǎo)其SARImRNA和蛋白的表達(dá);SARI啟動子區(qū)

9、含有轉(zhuǎn)錄因子STAT的結(jié)合位點(diǎn)。
　　結(jié)論:
　　(1)首次鑒定直接調(diào)控SARI的上游分子GR。(2)GR激動劑Dex能上調(diào)SARI表達(dá)進(jìn)而抑制淋巴瘤細(xì)胞增殖,這一現(xiàn)象能被GR拮抗劑Mfp逆轉(zhuǎn)。(3)上調(diào)SARI表達(dá)可能是地塞米松抗淋巴瘤的新機(jī)制,GR-SARI通路可能是淋巴瘤生物治療的新靶點(diǎn)。(4)Dex能抑制淋巴瘤增殖,調(diào)節(jié)AP-1活性及其靶基因p53/p21mRNA和蛋白表達(dá),該效應(yīng)是SARI依賴性的。SARI有望成為