促紅細(xì)胞生成素在人乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)及作用.pdf

1、目的：
　　選取不同轉(zhuǎn)移能力的乳腺癌細(xì)胞株（雌激素依賴低轉(zhuǎn)移MCF-7細(xì)胞株和雌激素不依賴高轉(zhuǎn)移MDA-MB-231細(xì)胞株）作為研究對象，從 mRNA及蛋白質(zhì)水平檢測促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）及促紅細(xì)胞生成素受體（erythropoietin receptor，EPO-R）的表達(dá)情況。選擇合適的rh-EPO濃度作用于乳腺癌癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231，檢測藥物對乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、分化及侵襲

2、轉(zhuǎn)移潛能等生物學(xué)行為的影響，明確EPO在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。根據(jù)篩選出的rh-EPO作用劑量和作用的不同時(shí)間，觀察炎性介質(zhì)COX-2含量的變化，探討COX-2是否參與了rhEPO促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
　　方法：
　　1.采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)、蛋白免疫印跡（Western Blot）方法及免疫細(xì)胞化學(xué)，檢測乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞株mRNA及蛋白質(zhì)水平EPO和EPO-

3、R的表達(dá)情況。2.經(jīng)不同濃度 rh-EPO處理后，用MTT法觀察rh-EPO對腫瘤細(xì)胞增殖效應(yīng)；AnnexinV-FITC/PI雙熒光染色和原位末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記 DNA鏈斷端分析法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dutp-Biotin nick end-labeling assay，TUNEL)檢測rh-EPO作用乳腺癌細(xì)胞后的凋亡情況；Tra ns well體外

4、遷移和侵襲運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)觀察經(jīng)不同濃度rh-EPO分別作用24h和48h后細(xì)胞侵襲和運(yùn)動(dòng)能力的變化。3.用ELISA檢測炎性介質(zhì)COX-2的水平變化，確定時(shí)效和量效關(guān)系，探討EPO/EPO-R的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1．RT-PCR、Western Blot及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞株中EPO及EPO-R均有表達(dá)，EPO及EPO-R蛋白的表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。
　　2．rh-EP

5、O對乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MDA-MB-231均有增加細(xì)胞活性和促進(jìn)增殖的效應(yīng)，并且呈時(shí)間劑量依賴性，且rh-EPO對于MCF-7的作用效果強(qiáng)于MDA-MB-231細(xì)胞。
　　3．AnnexinV-FITC雙熒光染色法顯示，對于MCF-7細(xì)胞，對照組、200U/ml、300U/ml、400U/ml實(shí)驗(yàn)組凋亡指數(shù)（AI）分別為（6.72±2.81）％、（7.17±2.36）%、（4.15±1.86）%、（6.58±1.28）%，四

6、組間AI值比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（，F(xiàn)=1.192，P=0.373）；對于 MDA-MB-231細(xì)胞，對照組、200U/ml、300U/ml、400U/ml實(shí)驗(yàn)組分別為（34.54±2.77）%、（32.45±1.46）%、（30.99±4.01）%、（29.80±3.44）%，四組間AI值比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.325，P=0.412）。
　　TUNEL檢測結(jié)果顯示，對于MCF-7細(xì)胞，對照組、200U/ml、300 U

7、/ml、400U/ml實(shí)驗(yàn)組凋亡指數(shù)（AI）分別為（8.07±0.118）%、（7.48±0.77）%、（7.07±0.90）%、（6.93±0.38）%，四組間AI值比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.204， P=0.189）；對于MDA-MB-231細(xì)胞，對照組、200U/ml、300U/ml、400U/ml實(shí)驗(yàn)組分別為（31.97±0.68）%、（31.32±0.886）%、（30.82±1.95）%、（29.90±2.26）%，四

8、組間AI值比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.894，P=0.485），表明rh-EPO并沒有抑制兩株細(xì)胞凋亡的作用。
　　4．Transwel遷移實(shí)驗(yàn)顯示，對于MCF-7細(xì)胞，200U/ml、300U/ml、400U/ml實(shí)驗(yàn)組24h遷移的細(xì)胞數(shù)分別為（23.00±2.12）、（27.60±2.07）、（43.75±5.31），高于對照組（6.60±1.51），各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=121.662，P=0.000）。對于MD

9、A-MB-231細(xì)胞，200U/ml、300 U/ml、400U/ml實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞24h遷移的細(xì)胞數(shù)分別為（130.50±4.93）、（231.50±2.38）、（347.75±3.20），高于對照組（62.60±1.52），各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6715.455，P=0.000）。
　　Transwel侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，對于MCF-7細(xì)胞，200U/ml、300U/ml、400U/ml實(shí)驗(yàn)組48h侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（18.60±

10、3.91）、（26.20±1.30）、（42.25±5.68），高于對照組（5.60±1.14），各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=92.103，P=0.000）。對于MDA-MB-231細(xì)胞，200U/ml、300U/ml、400U/ml實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞48h侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（119.80±5.81）、（206.80±4.32）、（295.00±20.82），高于對照組（55.75±1.95），各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=378.139，P=

11、0.000）。
　　rh-EPO作用于MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞株后，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均呈劑量依賴性提高。
　　6．rh-EPO可以引起MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞COX-2表達(dá)量呈時(shí)間劑量依賴性升高，且同樣條件下MCF-7細(xì)胞的COX-2表達(dá)量高于MDA-MB-231細(xì)胞的COX-2表達(dá)量。
　　結(jié)論：
　　1．乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MDA-MB-231均微弱表達(dá)EPO及EPO-R。將r

12、h-EPO作用于MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞株后，rh-EPO在不影響兩株癌細(xì)胞凋亡的情況下，一方面，呈時(shí)間劑量依賴性地促進(jìn)了兩株癌細(xì)胞的增殖活性，且rh-EPO對于MCF-7的作用效果強(qiáng)于MDA-MB-231細(xì)胞；另一方面，rh-EPO呈劑量依賴性地提高了兩株乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　2．rh-EPO對乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231促增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的作用可能由炎性介質(zhì)COX-2介導(dǎo)。兩株細(xì)胞COX-2