促紅細(xì)胞生成素在小鼠腦型瘧疾發(fā)生中的作用研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　 瘧疾是瘧原蟲經(jīng)媒介按蚊傳播的嚴(yán)重威脅人類健康的感染性寄生原蟲疾病。每年瘧疾臨床病例在2～3億左右，其中近百萬人因感染瘧疾死亡。紅內(nèi)期惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum，P.f)引起的腦型瘧疾(簡稱腦瘧，cerebral malaria,CM)是重癥患者致死的主要原因，因CM導(dǎo)致的死亡人數(shù)占瘧疾總死亡人數(shù)的80％,而幸存者仍長期伴有神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀。大量的研究表明，致死型腦瘧等嚴(yán)重并發(fā)癥的出現(xiàn)

2、與機(jī)體過強(qiáng)的Th1型應(yīng)答密切相關(guān)。血清中過量的前炎癥因子，尤其是IFN-γ、 TNF-a和NO參與CM的發(fā)生，并與高死亡率呈正相關(guān)。
　　 伯氏瘧原蟲(Plasmodium berghei ANKA，P.b ANKA)感染的鼠瘧模型疾病感染過程與P.f瘧疾感染的臨床表現(xiàn)有許多共同之處，是研究人類瘧疾疾病的最佳模型。研究表明，CM是腦血管內(nèi)感染紅細(xì)胞(parasitized red blood cells，pRBC)的黏附和細(xì)胞因

3、子與效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的宿主強(qiáng)烈前炎癥應(yīng)答的結(jié)合效應(yīng)。相關(guān)研究表明活化T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答參與疾病誘導(dǎo)，并且CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞均有利于腦病變發(fā)生。事實(shí)上，Th1型免疫應(yīng)答在控制蟲血癥方面發(fā)揮關(guān)鍵作用的同時(shí)也促進(jìn)CM發(fā)生。
　　 促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種糖蛋白，在成人體內(nèi)主要由腎臟產(chǎn)生，并能夠促進(jìn)紅系祖細(xì)胞分化為成熟的紅細(xì)胞，增加循環(huán)中紅細(xì)胞數(shù)量。EPO除了眾所周知的的造血功能外，還具有抗

4、炎、抗氧化和抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。研究證實(shí)，除了紅系祖細(xì)胞外，其它類型的細(xì)胞包括免疫細(xì)胞也表達(dá)EPOR，但尚不清楚這些受體的功能。新的研究表明，EPO可以調(diào)控免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，EPO對傳染病和炎癥性疾病有明顯影響，并對新治療策略的設(shè)計(jì)大有益處。P.b ANKA感染C57BL/6小鼠，通過EPO治療能夠提高其存活率，并減少小鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡。近些年的小鼠腦瘧模型實(shí)驗(yàn)中，也證實(shí)了rhEPO的治療可以減少小鼠腦內(nèi)前炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。EPO

5、通過抑制前炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，保留內(nèi)皮細(xì)胞的完整性和保護(hù)血腦屏障的通透性來抑制炎癥反應(yīng)。為此，我們研究了EPO對實(shí)驗(yàn)性腦瘧模型(P.b ANKA感染C57BL/6小鼠)中宿主免疫應(yīng)答的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理、感染及原蟲血癥觀察
　　 EPO處理:C57BL/6小鼠隨機(jī)分為2組:對照組;給藥組（EPO處理組）。實(shí)驗(yàn)組分別于感染后d2-4靜脈給予10U、50U、200U/只EPO，對照組在相

6、同的時(shí)間點(diǎn)接受相同量的生理鹽水。
　　 小鼠感染:經(jīng)腹腔感染1×106P.b ANKA寄生的紅細(xì)胞(pRBC)，感染不同時(shí)間的小鼠經(jīng)尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，鏡檢計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率。
　　 2.血腦屏障檢測
　　 于小鼠感染后d5靜脈注射200μl伊文思藍(lán)染料（2％ Evans blue dye，EB）（sigma公司），1小時(shí)后，經(jīng)心臟灌注生理鹽水直至流出清亮的液體為準(zhǔn)，取腦并放入裝有1ml甲酰胺

7、（sigma公司）中號試管中，37℃溫箱孵育48小時(shí)，3000 r/min離心15min，取上清液在于紫外分光光度儀上（波長630 nm）測定染料溢出物，檢測血腦屏障(BBB)的通透性。
　　 3.HE染色和免疫組化
　　 小鼠大腦被固定在4％多聚甲醛中，然后石蠟包埋和切片，免疫組化法(IHC)方法如下:
　　 1)石蠟切片，常規(guī)脫蠟脫水。
　　 2)3％ H2O2（無色液體）室溫孵育10分鐘，以滅活內(nèi)源

8、性過氧化物酶活性。
　　 3)蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘
　　 4)抗原修復(fù):枸櫞酸鈉緩沖液高壓修復(fù)2分鐘。自然冷卻，再用PBS3分鐘×3次。
　　 5)血清封閉:37℃孵育30分鐘，盡可能與二抗來源一致。傾去，勿洗。
　　 6)滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，4℃過夜（最好復(fù)溫）。PBS沖洗，3分鐘×5次。
　　 7)滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫或37℃孵育1小時(shí)。
　　 8) PBS沖洗，3分

9、鐘×5次。
　　 9)滴加SP（鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30分鐘。
　　 10) PBS沖洗，3分鐘×5次。
　　 11)顯色劑顯色（DAB等）。
　　 12)自來水充分沖洗以終止顯色。
　　 13)可進(jìn)行復(fù)染，脫水，透明。
　　 14)封片劑封片。
　　 4.脾細(xì)胞培養(yǎng)
　　 無菌取出感染d0、3、5小鼠脾臟，用10％ FCS-RPMI1640培養(yǎng)液制成

10、細(xì)胞懸液，1500rpm離心10min，用0.17 M NH4Cl裂解紅細(xì)胞，RPMI1640洗滌兩次。以含10％ FCS-RPMI1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1×107/ml，于24孔培養(yǎng)板上加入細(xì)胞懸液，500μl/孔，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔。于37℃培養(yǎng)48h。350g室溫離心10min，收集上清，-80℃保存，待IFN-γ、TNF-α和NO2檢測。
　　 5.IFN-γ及TNF檢測
　　 用雙抗體夾心ELISA法對小鼠脾細(xì)

11、胞培養(yǎng)上清中的IFN-γ以及TNF的含量分別進(jìn)行檢測，酶標(biāo)儀檢測450nm處OD值。應(yīng)用SoftMax Pro4.3.1 LS軟件分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg/ml)。
　　 6.NO2-檢測
　　 以Griess反應(yīng)檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的NO2-含量，100μl上清和Griess反應(yīng)液100μl室溫反應(yīng)10 min，用NaNO2作為標(biāo)準(zhǔn)品，酶標(biāo)檢測儀550nm處檢測其OD值。
　　 7.脾細(xì)

12、胞樣品制備及熒光抗體染色
　　 無菌取出感染后d0、3、5小鼠脾臟，常規(guī)方法制備脾細(xì)胞懸液，用0.17mol/LNH4Cl裂解紅細(xì)胞。用含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1×107/ml。DCs檢測:每份樣品用抗CD11 c-FITC單抗、抗CD11b-PE單抗、抗CD45R/B220-PerCP單抗和抗MHCⅡ-APC單抗進(jìn)行四色分析，另設(shè)陰性對照管，在預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的流式細(xì)胞儀專用染

13、色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1ml，再加入抗CD11c-FITC單抗、抗CD11b-PE單抗和抗CD45R/B220-PerCP單抗進(jìn)行表面染色，離心去上清后，用0.5ml PBS重懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。TLR9檢測:每份樣品應(yīng)用FITC標(biāo)記的抗小鼠CD11c單抗和Biotin標(biāo)記的抗小鼠TLR9單抗進(jìn)行雙色分析，另設(shè)單標(biāo)CD11c單抗和TLR9單抗對照管。每管預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體2μl。然后用抗CD11c-FITC單抗進(jìn)行

14、表面染色，振蕩器低速混勻，冰浴放置，避光反應(yīng)30min。每管加入2ml含2％ FCS的PBS，1500 rpm離心5min，棄上清，洗滌兩次。然后加入固定透膜夜250μl，4℃孵育1h。再加2ml1×wash固定透膜洗液，1500rpm離心5min洗滌1次，棄上清。每管加100ul含2％FCS的PBS重懸細(xì)胞。加入抗-TLR9-Biotin mAb進(jìn)行胞內(nèi)標(biāo)記，4℃孵育30 min。每管加入2ml含2％FCS的PBS，1500 rpm離

15、心5min，棄上清，洗滌兩次。加入抗-Streptavidin-PE進(jìn)行胞內(nèi)標(biāo)記，4℃孵育30 min。每管加入2ml含2％FCS的PBS，1500 rpm離心5min，棄上清，洗滌兩次。每管加入500μl2％多聚甲醛固定液重懸，靜置15min，上機(jī)。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件。單因素方差分析比較各組均值的顯著性差異。P小于0.05為差異顯著。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　

16、 1.EPO處理顯著降低P.b ANKA感染C57BL/6小鼠CM的發(fā)生
　　 對照組小鼠在感染后d7，出現(xiàn)明顯的腦瘧癥狀（如抽搐，皮毛豎起，顫抖，肢體癱瘓，痙攣，昏迷等神經(jīng)學(xué)癥狀），大多數(shù)小鼠與感染后d7-12死亡。為了確定EPO對實(shí)驗(yàn)性腦瘧的保護(hù)性作用，我們在小鼠感染后d2-4尾靜脈給予三種不同劑量（10，50，200 U/只/天）的重組人EPO(rhEPO)。與對照組相比，三種不同劑量的EPO都能對ECM發(fā)揮顯著的保護(hù)作用

17、。在三種劑量中，給予50U/只rhEPO實(shí)驗(yàn)組中，66％小鼠存活超過24天，存活時(shí)間最長，為此，采用此組劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。相比生存時(shí)間，原蟲血癥在對照組與各實(shí)驗(yàn)組之間無顯著差異。與正常小鼠相比，在感染后d3-5，小鼠外周血RBC計(jì)數(shù)發(fā)生波動(dòng)，但是EPO組與對照組比較無明顯差異。C57BL/6感染P.b ANKA后，血小板計(jì)數(shù)呈下降趨勢，但是兩組比較無明顯差異。
　　 2.EPO處理改善實(shí)驗(yàn)性腦瘧的病理癥狀
　　 在小鼠感

18、染后d5，當(dāng)小鼠出現(xiàn)腦瘧癥狀時(shí)取腦。與正常小鼠相比，組織學(xué)檢查顯示，對照組小鼠腦血管內(nèi)白細(xì)胞聚集物明顯增多，并在小鼠腦組織的不同區(qū)域出現(xiàn)血管堵塞。相反，EPO組小鼠腦微血管中炎性細(xì)胞的沉積減少。另外，在對照組小鼠腦微血管中，免疫組化檢測證實(shí)黏附分子ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)增強(qiáng)，而EPO組表達(dá)減少。通過檢測小鼠腦組織EB的含量作為評價(jià)血腦屏障完整性的指標(biāo)。與對照組相比，EPO治療組腦組織的EB滲出顯著減少。
　　 3.EP

19、O處理降低血漿中TNF和IFN-γ水平
　　 在小鼠感染后d5，對照組小鼠血漿中TNF和IL-10水平明顯升高。然而，EPO組小鼠血清中TNF的水平在感染后d5明顯降低。EPO組小鼠血清中IFN-γ的水平在感染后d5減少。相反，EPO組小鼠血清中抗炎癥細(xì)胞因子IL-10的水平在感染后d5升高。
　　 4.EPO抑制Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答
　　 與感染后d0相比，EPO組Th1型細(xì)胞（CD4+T-bet+IFN-γ+細(xì)

20、胞）的數(shù)量在感染后d3、5顯著升高。與感后d0相比，對照組在感染后d3、5小鼠脾細(xì)胞中巨噬細(xì)胞(F4/80+細(xì)胞)的數(shù)量均出現(xiàn)升高趨勢;與對照組小鼠相比，EPO組在感染后d3、5小鼠脾細(xì)胞中巨噬細(xì)胞的數(shù)量均減少。同時(shí)，在感染后d3、5，EPO組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO和IFN-γ的分泌水平出現(xiàn)顯著降低。EPO組TNF的分泌水平也明顯降低。同時(shí)，體外加入5 U/ml的rhEPO培養(yǎng)脾細(xì)胞，也可降低TNF和IFN-γ的分泌水平。
　　

21、 5.EPO處理提高Tregs數(shù)量并增加IL-10分泌
　　 在小鼠感染后d3、5，檢測脾細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+Tregs的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，EPO組的數(shù)量均出現(xiàn)顯著增高。同時(shí)，在小鼠感染后d5，檢測脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-10的分泌水平，發(fā)現(xiàn)EPO組升高。同時(shí)，體外培養(yǎng)脾細(xì)胞并加入rhEPO刺激，ELISA檢測加入刺激物時(shí)IL-10的分泌水平升高。
　　 6.EPO下調(diào)DCs數(shù)量
　　 在小鼠

22、感染后d3、5，與對照組相比，EPO組髓樣DCs(mDCs)和漿樣DCs(pDC)的數(shù)量顯著減少。在小鼠感染后d5，EPO組中DCs表面分子TLR4和TLR9的表達(dá)也降低，感染后d3兩組之間差異顯著。
　　 結(jié)論:
　　 1.EPO處理顯著降低P.b ANKA感染C57BL/6小鼠CM的發(fā)生;
　　 2.EPO處理改善實(shí)驗(yàn)性腦瘧的病理癥狀;
　　 3.EPO抑制Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答，降低血漿中TNF和IFN