骨髓間充質(zhì)干細胞對光損傷視網(wǎng)膜的保護作用與機制.pdf

1、隨著對間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)認識的深入,MSCs的定義已經(jīng)超出了作為一種具有多向分化潛能成體干細胞的概念。MSCs被認為是多源的細胞群體,廣泛參與了組織修復。MSCs可能通過細胞因子分泌和調(diào)節(jié)機體微環(huán)境促進損傷修復過程,然而其確切的機制尚不清楚。本研究采用體外模型探討視網(wǎng)膜光損傷對MSCs細胞因子表達變化的影響,并進一步闡述細胞因子表達變化在MSCs參與視網(wǎng)膜變性過程的作用。通過體內(nèi)移植研

2、究MSCs在視網(wǎng)膜光損傷中的作用及移植介導的宿主細胞因子表達變化。
　　第一部分:視網(wǎng)膜光損傷動物模型研究
　　目的:建立視網(wǎng)膜光損傷動物模型,探討光損傷對視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的影響及光損傷誘導的內(nèi)源性細胞因子表達變化。
　　方法:6~8WSD大鼠經(jīng)散瞳后,進行12h光照(5klux),12h避光,每日反復。并于強光暴露后1d、2d、5d、7d、14d摘除眼球。采用透射電鏡觀察光照早期視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)的改變。HE染色觀察強光暴

3、露對視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的影響。末端脫氧核苷酸標記法(TUNEL)檢測光照后視網(wǎng)膜細胞凋亡情況。采用墨汁灌注及視網(wǎng)膜鋪片法評估光照后視網(wǎng)膜微循環(huán)通透性改變。免疫熒光檢測視網(wǎng)膜細胞因子bFGF、BDNF、CNTF的表達變化。
　　結(jié)果:強光暴露24h后,視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變,光感受器細胞外節(jié)膜盤大量脫落,線粒體膜腫脹,核電子密度增高。視網(wǎng)膜組織學結(jié)構(gòu)隨光照時間的延長而持續(xù)破壞,視網(wǎng)膜外核層進行性變薄。視網(wǎng)膜細胞凋亡于光照后持續(xù)存在,主要

4、分布于外核層及視網(wǎng)膜色素上皮層。強光暴露視網(wǎng)膜微血管通透性增強,墨汁灌注出現(xiàn)點狀滲出,光照14d后出現(xiàn)片狀滲漏,位于深層。強光暴露引起視網(wǎng)膜bFGF、BDNF、CNTF及GFAP表達上調(diào)。其中CNTF及GFAP表達上調(diào)隨光照時間延長而增強。
　　結(jié)論:強光暴露可以引起視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)破壞并出現(xiàn)反應性細胞因子表達上調(diào),視網(wǎng)膜光損傷伴隨膠質(zhì)細胞反應增強。
　　第二部分:視網(wǎng)膜光損傷對骨髓間充質(zhì)干細胞神經(jīng)保護功能的影響
　　目

5、的:探討光損傷視網(wǎng)膜勻漿上清液對MSCs細胞因子表達的影響及細胞因子表達變化在MSCs參與視網(wǎng)膜變性過程的作用。
　　方法:全骨髓貼壁法培養(yǎng)MSCs,并進行流式細胞術(shù)、成骨及成脂分化鑒定。制備正常及光損傷視網(wǎng)膜勻漿上清液,分別誘導第3~5代MSCs2d及5d。采用RT-qPCR及Western-blotting檢測bFGF、BDNF、CNTF表達情況并與未誘導組MSCs比較。收集未誘導及誘導后MSCs培養(yǎng)上清液,制備條件培養(yǎng)液,培

6、養(yǎng)視網(wǎng)膜片24h。收集視網(wǎng)膜片培養(yǎng)液,通過LDH釋放水平評估不同條件培養(yǎng)液對視網(wǎng)膜細胞膜完整性的影響。RT-qPCR檢測不同條件培養(yǎng)液對視網(wǎng)膜bcl-2及bax表達的影響。構(gòu)建含bFGF干擾序列的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染MSCs并進一步誘導轉(zhuǎn)染后的MSCs,觀察bFGF表達下調(diào)對MSCs發(fā)揮視網(wǎng)膜神經(jīng)保護作用的影響。
　　結(jié)果:MSCs可以表達bFGF、BDNF、CNTF。經(jīng)光損傷視網(wǎng)膜勻漿上清液誘導后,MSCs表達bFGF及CNTF顯著

7、增強(P<0.05)。MSCs條件培養(yǎng)液上調(diào)視網(wǎng)膜片bcl-2表達,抑制bax表達及LDH釋放。光損傷視網(wǎng)膜勻漿上清液誘導后的MSCs條件培養(yǎng)液較其它條件培養(yǎng)液顯著提高其上調(diào)視網(wǎng)膜片bcl-2表達,抑制bax表達及LDH釋放的能力(均P<0.05)。bFGF表達下調(diào)后的MSCs條件培養(yǎng)液仍可上調(diào)視網(wǎng)膜片bcl-2表達,抑制LDH釋放。但各條件培養(yǎng)液組間比較無顯著性差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:損傷刺激可以促進MSCs細胞因子表

8、達,增強MSCs的視網(wǎng)膜神經(jīng)保護作用,損傷誘導的bFGF表達上調(diào)在MSCs應對視網(wǎng)膜變性中具有重要作用。
　　第三部分:經(jīng)靜脈移植骨髓間充質(zhì)干細胞對光損傷視網(wǎng)膜的影響
　　目的:探討MSCs靜脈移植對光損傷視網(wǎng)膜細胞凋亡的影響及移植后細胞遷移和移植介導的宿主細胞因子表達變化。
　　方法:建立視網(wǎng)膜光損傷動物模型,MSCs注射組于強光暴露48h后,經(jīng)靜脈移植MSCs,劑量5×106個/ml,DMEM注射組接受等體積的DM

9、EM注射。采用TUNEL比較光照14d后單純光照組、DMEM注射組及MSCs注射組視網(wǎng)膜細胞凋亡情況,HE染色比較各組視網(wǎng)膜外核層厚度變化情況,Western-blotting檢測光照1d、2d、5d、7d、14d各組視網(wǎng)膜CNTF及GFAP的表達情況。免疫熒光雙重標記檢測CNTF與GFAP的定位情況。采用GFP標記的MSCs靜脈移植觀察移植后細胞在視網(wǎng)膜的橫向及縱向分布情況。
　　結(jié)果:經(jīng)靜脈移植的MSCs可以移行并遷移出視網(wǎng)膜