骨髓間充質(zhì)干細胞對于髓核細胞炎性損傷的保護作用.pdf

1、目的:在椎間盤退行性病變過程中，椎間盤內(nèi)微環(huán)境中IL-1β表達的升高被認為是其重要的致病因素，而間充質(zhì)干細胞治療椎間盤退行性病變也被認為是具有巨大潛力的治療策略。在眾多實驗中間充質(zhì)干細胞都表現(xiàn)出良好的髓核細胞分化特性，以及體外實驗中良好的恢復椎間盤高度的能力，本實驗將從體外評價骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)對白介素1β(IL-1β)干預(yù)后的髓核(NP)細胞保護修復能力。
　　方法:
　　1.實驗細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定以及實驗

2、分組。一型膠原，二型膠原的細胞免疫組化鑒定。取三代BMSCs通過流式細胞儀進行CD29、CD31、CD45、CD90位點鑒定細胞純度。實驗共分為三組:1.對照組:在無血清培養(yǎng)基條件下24 h后更換為含有完全培養(yǎng)基24h。2.炎性干預(yù)組（A組）:在無血清培養(yǎng)基條件下加入IL-1β(20ng/ml)干預(yù)24h后更換為含有完全培養(yǎng)基24h。3.共培養(yǎng)組（B組）:在無血清培養(yǎng)基條件下加入IL-1β(20ng/ml)干預(yù)24h后，更換含有完全培養(yǎng)

3、基同時置入預(yù)先種入BMSCs細胞的transwell小室，共培養(yǎng)24h，三組實驗都分為2個階段，時間各24h。
　　2.Realtime-PCR: BMSCs非接觸共培養(yǎng)下炎性干預(yù)的NP細胞中基因的表達。采用Realtime-PCR檢測三組獲得NP細胞的ADAMTS-4、5、7，MMP-3、13，TIMP-1的基因相對表達量。
　　3.細胞凋亡的檢測:根據(jù)beyotime提供的Caspase-3活性檢測試劑盒說明書，對于三組

4、細胞CASPASE-3的活性進行檢測。同時還對于三組細胞進行TUNEL染色，觀察三組細胞的TUNEL染色的活性，進行比較。BMSCs非接觸共培養(yǎng)下炎性干預(yù)的NP細胞凋亡比例變化。取各組NP細胞，使用Annexin V(PE)/PI流式試劑盒檢測凋亡的變化。在流式檢測中，加入直接共培養(yǎng)（C組），使用相同數(shù)量的GFP-BMSCs直接加入炎性因子損失的NP細胞中，觀察四組髓核細胞凋亡數(shù)量的變化。
　　4.細胞遷徙的檢測:對于0ng/ml

5、，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml濃度的IL-1β干預(yù)髓核細胞24h，將transwell板由換成8-μm孔徑的濾板，通過四組的比較，觀察BMSCs對于炎性損傷的NP細胞的遷徙能力。
　　5.線粒體染色現(xiàn)象觀察:使用24孔提前鋪片，使用IL-1β(20ng/ml)干預(yù)NP細胞24h之后，加入使用帶有GFP熒光的BMSCs，GFP-BMSCs使用線粒體染料預(yù)染色，直接接觸共培養(yǎng)24h后，將細胞玻片取出在共聚焦顯微鏡下觀

6、察。
　　結(jié)果:
　　1.NP細胞、BMSCs純度鑒定。BMSCs傳至第3代通過流式細胞儀通過CD29、CD31、CD45、CD90位點鑒定細胞純度，BMSCs的流式鑒定結(jié)果顯示90％以上的BMSCs表現(xiàn)為CD29，CD90陽性，小于5％的BMSCs的CD31及CD45陽性，細胞純度較好。髓核細胞免疫組化顯示的二型膠原表達較好，符合NP細胞的膠原表達特點。
　　2.Realtime-PCR結(jié)果，相比于對照組，A組中AD

7、AMTS-4，ADAMTS-5，ADAMTS-7，MMP-13，MMP-3表達顯著升高，五組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。而相比A組，B組各項退變指標基因表達量顯著降低，五組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05）。
　　3.細胞凋亡檢測:三組細胞TUNEL染色顯示炎性刺激組（A組）髓核細胞凋亡明顯增加，BMSCs共培養(yǎng)組（B組）對于炎性因子導致的凋亡細胞的數(shù)量的增產(chǎn)生有效的抑制。在Caspase-3的檢測中，A組比較

8、對照組caspase-3活性升高明顯，二者之間差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05），而相比于A組，B組中Caspase-3活性下降，二者之間差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。AnnexinⅤ(PE)/PI流式結(jié)果，與對照組相比，A組NP細胞在炎性因子刺激下凋亡增加明顯，二者之間差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。經(jīng)過BMSCs間接共同培養(yǎng)（B組）后，相比于A組，NP細胞凋亡下降明顯，二者之間差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。AnnexinⅤ(

9、PE)/PI流式結(jié)果中，直接共培養(yǎng)的結(jié)果（C組）和間接共培養(yǎng)組（B組）對凋亡都有抑制作用，但兩者無統(tǒng)計學差異。
　　4.BMSCs遷徙結(jié)果:通過考馬斯亮藍染色后BMSCs細胞數(shù)量的比較，可以發(fā)現(xiàn)，IL-1β濃度的不斷升高，即隨著炎性因子對于髓核細胞損傷的程度不斷增加，BMSCs對于髓核細胞的遷徙能力不斷增強。四組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　5.線粒體一體化結(jié)果:從圖可以看出GFP-BMSCs可以通過隧道納

10、米管，將線粒體傳輸進炎性損傷的NP細胞內(nèi)，完成細胞之間的直接營養(yǎng)作用。
　　結(jié)論:BMSCs可通過旁分泌的方式，有效降低炎性所致的NP細胞退變和凋亡的比例，說明BMSCs作為種子細胞在椎間盤退行性病變的治療中，對于椎間盤炎性環(huán)境的“治療”作用不可忽視。同時BMSCs可以炎性損傷的NP細胞進行遷移，說明BMSCs可以在椎間盤內(nèi)炎性內(nèi)環(huán)境嚴重的部位遷徙，發(fā)揮治療作用，以及我們觀察到在直接共培養(yǎng)的時候，BMSCs可以通過隧道納米管，向損