骨髓間充質(zhì)干細胞對阿霉素腎病大鼠的保護作用及機制的研究.pdf

1、目的：1、分離和培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），并鑒定其相關(guān)生物學特性。
　　2、通過注射鹽酸阿霉素建立大鼠阿霉素腎病模型。
　　3、通過電鏡觀察，檢測生化，應用RT-PCR、Real time PCR、Western blot和ELASA技術(shù)觀察BMSCs移植和強的松治療保護大鼠阿霉素腎病的效果，并對骨髓間充質(zhì)干細胞在阿霉素腎病大鼠中保護作用及機

2、制進行探討。
　　方法：1、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）的提取、培養(yǎng)與鑒定：通過大鼠淋巴細胞分離液分離出單個核細胞層，密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選方法分離培養(yǎng)，不斷傳代、擴增，并通過流式細胞儀表面標志鑒定與成骨和成脂誘導這兩種方法結(jié)合起來鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學特性。
　　2、大鼠阿霉素腎病模型建立：通過非麻醉狀態(tài)下尾靜脈一次性按7.5mg/Kg體重注射鹽酸阿霉素，注射鹽酸阿霉素14d后，綜合各項結(jié)果：一般表現(xiàn)，24

3、h尿蛋白定量、肌酐等各項生化指標的檢測，同時結(jié)合腎臟組織HE染色及電鏡形態(tài)學觀察是否符合大鼠阿霉素腎病模型的要求。
　　3、BMSCs對阿霉素腎病大鼠的保護作用及機制的研究：①實驗分組：模型組；強的松組；MSC組；正常對照組。②采用電鏡觀察干預后4w各實驗組腎臟足細胞結(jié)構(gòu)；采用常規(guī)生化檢測方法動態(tài)觀察各實驗組大鼠24h尿蛋白定量、肌酐等各項生化指標。③應用ELASA檢測單核細胞趨化因子-1（Monocyte chemotactic

4、 protein-1，MCP-1）在不同時間點各實驗組大鼠血清中表達改變情況。④應用RT-PCR、Real time PCR和western blot技術(shù)動態(tài)觀察足細胞裂孔膜蛋白及骨架相關(guān)蛋白nephrin、podocin、synaptopodin，p21，MCP-1在各實驗組不同時間點mRNA水平和蛋白水平表達改變情況。
　　結(jié)果：1、通過密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選方法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs細胞易分離，培養(yǎng)，細胞具有間質(zhì)細胞的表

5、面抗原特征，不具有造血干細胞的表面抗原特征，純度高，活性高及多向分化潛能，完全符合大鼠BMSCs的生物學特性。
　　2、注射鹽酸阿霉素14d后，綜合各項結(jié)果判定本方法大鼠阿霉素腎病模型建立成功，符合實驗要求。
　　3、①干預后4w，MSC組、強的松組與模型組相比，腎臟組織中足細胞足突融合及微絨毛變性明顯減少，MSC對阿霉素所造成的足細胞結(jié)構(gòu)的破壞起到一定的保護作用。② MSC輸注后，MSC組中24h尿蛋白定量、肌酐、尿素氮、

6、膽固醇、甘油三酯和白蛋白與模型組相比得到很大程度的改善，大鼠的腎臟功能得到了保護，尤其是24h尿蛋白定量減少明顯。③干預后2w,MSC組和強的松組中血清中MCP-1表達相對于模型組明顯下降，干預后4w和8w，MSC控制炎癥能力有所下降，但相對于模型組血清中MCP-1表達仍然是降低的。④干預后4w，MSC組、強的松組與模型組相比，腎皮質(zhì)中synaptopodin和p21 mRNA表達明顯上調(diào)。⑤干預后4w，Western blot表明MS

7、C組、強的松組與模型組比較synaptopodin和p21蛋白的表達得到上調(diào)。
　　結(jié)論：1、通過密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選方法能夠成功從大鼠骨髓中分離出高純度、高活性的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞。
　　2、經(jīng)尾靜脈一次性按7.5mg/Kg體重注射鹽酸阿霉素能夠成功建立大鼠阿霉素腎病模型。
　　3、根據(jù)本實驗結(jié)果表明MSC保護阿霉素腎病大鼠的機制之一是：MSC的輸注抑制了腎組織內(nèi)MCP-1的產(chǎn)生，減輕了腎組織的炎癥損傷，通過