與慢加急性肝衰竭(ACLF)相關的乙型肝炎病毒(HBV)突變位點的研究.pdf

1、乙型病毒性肝炎仍是一個世界性的公共衛(wèi)生問題，全球范圍內乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的慢性感染人群高達3.5億以上。HBV相關的慢加急性肝衰竭(acute on chronic liver failure，ACLF)是慢性肝炎患者死亡的重要原因，如果不進行肝移植，其死亡率高達60-80％，每年大約有22600的患者死于肝衰竭。長期以來宿主免疫一直被認為是乙型肝炎加劇的主要原因，但是近年的研究結果表明病毒因素在

2、ACLF的發(fā)病中同樣起重要作用。HBV是嗜肝病毒家族的一員，其DNA全長約為3200個核苷酸，呈現部分雙鏈環(huán)狀。HBV基因組包含4個相互重疊的開放性讀碼框，分別編碼HBV表面抗原、核心抗原、聚合酶和多功能的非結構性蛋白X。由于HBV的復制過程包含前基因組RNA的逆轉錄，其逆轉錄酶缺乏校正功能，故HBV的突變率顯著高于其它的DNA病毒。HBV基因組的突變率可隨著病毒的復制不斷增加，其中一些突變可能與慢性肝炎的急性加劇相關，可作為ACLF的

3、預警的生物標志物和抗病毒治療的靶標。近來有研究表明基本核心啟動子區(qū)的A1762T/G1764A突變與ACLF發(fā)病相關，A1846T、G1896A和C1913A/G位點的突變在ACLF患者中發(fā)生率顯著高于慢性肝炎患者。目前關于HBV突變和ACLF發(fā)病的關系主要集中于基本核心啟動子區(qū)和前核心區(qū)，對HBV基因其它部位的研究尚少。ACLF是否有另外的一些HBV突變位點與ACLF發(fā)病有關尚不清楚，為此本研究用HBV全基因組測序篩選出與ACLF發(fā)病

4、相關的HBV突變，并發(fā)現一些新的突變位點，經過擴大樣本的驗證，以期為ACLF的預警提供依據。
　　方法：
　　1 HBV全基因測序篩選與ACLF發(fā)病可能相關的HBV突變位點
　　1.1 Illumina高通量測序。樣本來自兩組(12例ACLF和12例慢性輕度乙型肝炎(mildchronic hepatitis B，CHB-M))年齡配對、性別和基因型分布無顯著差異患者，所有樣本HBV的DNA水平均＞100，000 co

5、pies/mL。首先從200μl的血清中提取病毒DNA，分3段重疊擴增HBV全基因組。PCR產物在Genome AnalyzerⅡ平臺上進行高通量測序，然后處理高通量測序數據。
　　1.2檢測上述樣本的肝功能指標(ALT，AST，TBIL，PTA)，HBV血清標記物和HBV DNA滴度。
　　1.3分析GenBank數據庫的HBV基因突變情況:在GenBank數據庫中搜索中國地區(qū)報道的ACLF和CHB-M相關的HBV全基因序

6、列共258條(ACLF患者序列143條，CHB-M患者序列115條)，分析其突變。
　　2 HBV突變與ACLF發(fā)病的關系的驗證
　　2.1樣本。來自80例無癥狀攜帶者(asymptomatic carriers，ASC)、152例CHB-M、102例慢性重度乙型肝炎患者(severe chronic hepatitis B，CHB-S)和104例ACLF患者，共438例。
　　2.2從200μl血清中提取HBV DN

7、A，半巢式PCR擴增HBV基因組目標序列，PCR產物行常規(guī)Sanger測序。
　　2.3檢測上述樣本肝功能指標，HBV血清標記物和HBV DNA滴度。
　　結果：
　　1 Illumina高通量測序篩選結果
　　1.1作為質量控制的質粒測序結果顯示:所測得的讀長36bpDNA序列的不同位置發(fā)生測序錯誤的頻率不一致，在20位堿基之后其堿基替換率呈現上升趨勢，當位于序列的第30-36個堿基時，測序的錯誤率顯著上升。為

8、了降低錯配率，我們截取每個短片段序列前面的20bp進行質粒全長的拼接。質粒序列的總體誤差率為0.49％，其中每一百個核苷酸中錯配堿基讀取頻率＞4％的核苷酸平均為2.4個，將4％作為區(qū)分真實突變和技術誤差的界線。
　　1.2 T216C、G285A、A1846T、G1896A、C1913A/G、G2095A、 A2159G、 A2189C和G2345A為ACLF患者常見的突變位點，在12例ACLF患者中發(fā)生上述突變的病例數分別為10

9、例、9例、10例、10例、8例、5例、10例、11例和7例。
　　1.3 T216C、G285A、A1846T、G1896A、C1913A/G、G2095A、 A2159G、 A2189C和G2345A這9個位點的突變頻率在ACLF患者中顯著高于慢性輕度肝炎患者（P＜0.05或P＜0.01）。
　　1.4基本核心啟動子區(qū)(basal core promoter，BCP)(A1762T/G1764A)突變在12例ACLF和12

10、例CHB-M患者中的發(fā)生率均為6例。其突變頻率在ACLF患者和慢性輕度肝炎患者未見顯著差異。
　　1.5從Genbank數據庫下載258條HBV全基因序列，分析上述突變的分布情況發(fā)現:T216C、G285A、A1846T、G1896A、C1913A/G、A2159G、A2189C和G1764A在ACLF中的發(fā)生率均顯著高于CHB-M，G2095A、G2345A和A1762T在ACLF組和CHB-M組間未見差異。分別對HBV B基因

11、型和C基因型患者的突變進行分析發(fā)現，在B基因型的患者中，T216C、G285A、A1846T、G1896A和C1913A/G這5個位點突變在ACLF組中顯著高于CHB-M組;C基因型患者中，A1846T、C1913A/G、A2159G、A2189C和G1764A這5個突變在ACLF組中顯著高于CHB-M組。A1762T/G1764A雙聯(lián)突變在B基因型和C基因型的ACLF患者中均未見顯著升高。
　　2 HBV點突變與ACLF發(fā)病的關

12、系的驗證結果
　　2.1 ACLF組的B基因型比率顯著高于其余三組慢性乙型肝炎患者。
　　2.2 T216C、G285A、A1846T/G、G1896A、C1913A/G、A2159G/C和A2189T/C這7個突變的發(fā)生率在ACLF組顯著高于ASC、CHB-M和CHB-S組（P＜0.05或P＜0.01）。
　　2.3 T216C、G285A、A1846T/G、G1896A、C1913A/G這5個位點在HBV基因型B的

13、感染者中顯著高于HBV基因型C感染者。
　　2.4對ASC、CHB-M、CHB-S和ACLF患者的B基因型和C基因型毒株的突變進行比較發(fā)現:以ASCs為對照組，B基因型毒株感染者中，T216C、G285A、G1896A、C1913A/G突變在CHB-S和ACLF組中均顯著升高; C基因型毒株感染者中，A1846T/G、G1896A、C1913A/G、A2159G/C突變在ACLF組和CHB-S組中顯著升高。以CHB-M為對照組，H

14、BV B基因型毒株感染者中，T216C、G285A、G1896A、C1913A/G和A2159G/C在ACLF患者中顯著升高;C基因型毒株感染者中，G285A、A1846T/G、G1896A和C1913A/G在ACLF患者中顯著升高。當以CHB-S為對照時，基因型B毒株感染者中，A2159G/C和A2189T/C在ACLF組中顯著升高。
　　2.5與非ACLF組比較，B基因型毒株的T216C、G285A、A1846T/G、G189

15、6A、C1913A/G、A2159G/C和A2189T/C與ACLF密切相關，而C基因型毒株的G285A、A1846T/G、G1896A、C1913A/G和A2159G/C與ACLF密切相關。
　　2.6多因素分析顯示T216C、G1896A、C1913A/G和A2159G/C是ACLF發(fā)病的獨立危險因素。
　　2.7 T216C、G1896A、C1913A/G和A2159G/C的兩個或以上的聯(lián)合突變與ACLF發(fā)生密切相關。

16、
　　2.8“含C216的聯(lián)合突變”，“含A/G1913的聯(lián)合突變”，“含G/C2159的聯(lián)合突變”對ACLF診斷具有較高的特異性。
　　結論：
　　1B基因型病毒感染的慢性乙型肝炎患者更容易發(fā)展為ACLF。
　　2 T216C、G1896A、C1913A/G和A2159G/C突變?yōu)锳CLF發(fā)生的獨立危險因素。其中T216C和A2159G/C系本研究新發(fā)現的ACLF發(fā)病的獨立危險因素(T216C位點已申請國際專利